우리는 잘 통제 된 생리적 조건에서 작은 저항 또는 큰 도관 혈관의 반응성을 측정하기위한 황금 표준 프로토콜로서 등척성 또는 tensometric 근조영술을 입증합니다. 측정은 재현성이 높고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술은 연구자가 혈관의 다른 층을 개별적으로 연구하거나 혈관벽의 다른 층 간의 상호 작용을 동시에 조사 할 수있게하는 데 매우 유용합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구실 전문가 인 Robert Folk가 될 것입니다. 수조를 켜고 섭씨 37도로 설정하여 시작하십시오. 적절하게 표시된 두 개의 비커를 수조에 넣는데, 하나는 600 밀리리터의 HEPES-PSS 용액이 들어 있고 다른 하나는 150 밀리리터의 고 칼륨 용액이 들어 있습니다.
300ml의 HEPES-PSS 용액이 들어있는 비커에 카보 겐 가스를 10 분 이상 폭기시킵니다. 폭기 된 HEPES-PSS 용액 30 밀리리터를 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 넣고 적절하게 라벨을 붙인 다음 얼음 위에 놓습니다. 대동맥 박리 과정에서 사용할 얼음 위에 남은 폭기 된 HEPES-PSS 용액을 보관하십시오.
각 근위계 챔버에 5 밀리리터의 HEPES-PSS 용액으로 4 챔버 근압계 장치를 켜고 열을 섭씨 37 도로 설정하십시오. 각 챔버의 용액을 30분 동안 통기시키고 챔버가 원하는 섭씨 37도에 도달했는지 확인하십시오. 근초음파 데이터 수집 하드웨어와 컴퓨터를 켭니다.
안락사 된 마우스에서 절제 된 흉곽을 얼음처럼 차가운 폭기 된 HEPES-PSS 버퍼로 채워진 투명한 실리콘 엘라스토머 코팅 페트리 접시에 옮기고 양쪽에 고정시킵니다. 현미경으로 흉곽에서 심장과 부착 된 대동맥을 부드럽게 자르고 제거하고 깨끗한 실리콘 엘라스토머 코팅 접시로 옮긴 다음 대동맥에서 지방 결합 조직과 응고 된 혈액을 부드럽게 제거합니다. 날카로운 작은 가위를 사용하여 아치 영역에서 시작하여 하행 대동맥의 바닥까지 전체 대동맥을 해부하고 분리하십시오.
해부 된 대동맥을 각각 2 밀리미터의 4 개의 세그먼트로 자릅니다. 접시 안의 미니 자를 참조로 사용하십시오. 이미 5 밀리리터의 따뜻하고 폭기 된 HEPES-PSS 버퍼가 들어있는 챔버에서 집게를 사용하여 2 밀리미터 대동맥 세그먼트 각각을 두 개의 장착 핀에 조심스럽게 밀어 넣습니다.
챔버를 근전도 장치에 다시 놓을 때 대동맥 세그먼트가 핀에서 미끄러지지 않도록 마이크로미터를 시계 반대 방향으로 돌려 핀을 천천히 벌립니다. 각 근초음파 챔버를 장치로 되돌리고 섭씨 37도에서 20분 동안 챔버 통기를 시작합니다. 챔버를 배수하고 5 밀리리터의 신선하고 따뜻하며 폭기 된 HEPES-PSS 용액을 각 챔버에 첨가하십시오.
필요한 경우 힘 측정값을 다시 조정하여 6밀리뉴턴의 최적 장력을 읽습니다. 조직을 15-20 분 더 쉬십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다.
추적 번호를 50에서 1, 500에서 1로 변경하고 시작을 누릅니다. 새로운 실험을 시작하기 전에 데이터 수집 소프트웨어에 적절한 라벨을 추가해야 합니다. 각 챔버에 5 밀리리터의 고 칼륨 용액을 추가하기 전에 챔버를 한 번 더 배수하십시오.
고 칼륨 용액에 대한 수축 반응이 힘 생성을 위해 고원에 도달하자마자 챔버를 다시 배수하십시오. HEPES-PSS 용액으로 조직을 세 번 씻으십시오. 각 챔버에 5 밀리리터의 고 칼륨 용액을 첨가하십시오.
고 칼륨 용액에 대한 수축 반응이 힘 생성을 위해 고원에 도달하자마자 챔버를 배수하고 HEPES-PSS로 조직을 세 번 씻은 다음 15-20 분 동안 조직을 휴지시킵니다. 대동맥 분절을 혈관 수축 제제 PE와 최대 이하 용량으로 사전 계약합니다. PE로 인한 수축 곡선이 장력 발달을 위해 고원에 도달하도록 합니다.
텍스트 원고에 설명 된대로 근위압계 챔버에서 50 피코몰에서 10 마이크로 몰까지 아세틸 콜린의 최종 농도를 설정하기 위해 3 분 간격으로 5 마이크로 리터의 증가하는 용량의 아세틸 콜린 작업 스톡 용액에서 PE에 장력 발달 고원을 추가합니다. 용량 반응 실험을 완료 한 후, 챔버를 배수하고, 대동맥 세그먼트를 따뜻하고 폭기 된 HEPES-PSS 용액으로 세 번 씻고 30 분 동안 조직을 휴지시킨다. 대동맥 분절을 30 분 동안 휴식 한 후 챔버를 배수하고 신선하고 따뜻한 고 칼륨 용액을 각 챔버에 추가 한 다음 챔버를 배수하고 HEPES-PSS 용액으로 조직을 씻습니다 높은 칼륨 용액에 대한 수축 반응이 앞에서 설명한 것처럼 F 고원에 도달합니다.
관찰된 아세틸콜린 유도 혈관 이완에 대한 산화질소 생성의 기여도를 평가하기 위해 준비된 100밀리몰 작업 스톡 용액 100마이크로리터를 추가하여 대동맥 세그먼트를 L-NAME으로 사전 배양합니다. L 이름을 제거하지 않고 대동맥 수축을 유도하기 위해 PE의 최대 부하 미만을 챔버에 추가하십시오. PE 유도 수축 곡선이 장력 발달을 위해 고원에 도달 할 때까지 기다린 다음 근도계 챔버에 아세틸 콜린을 추가하여 최종 농도 500 나노 몰을 달성합니다.
형성된 고원이 안정 될 때까지 힘 개발의 가능한 변화를 등록하기 위해 몇 분 동안 기다리십시오. 챔버를 배수하고 따뜻한 폭기 된 HEPES-PSS 용액으로 조직을 세 번 씻으십시오. 현미경 아래에 근전도 챔버를 놓고 대동맥의 내강을 통해 작은 와이어를 부드럽게 통과시킵니다.
짧은 시간 동안 루멘을 통해 와이어를 부드럽게 움직입니다. 대동맥을 2mm 대동맥 고리로 자르고 그 고리를 근전도 챔버에 장착하십시오. 최적의 장력을 6 밀리 뉴턴으로 설정하고 폭기 된 따뜻한 hepes-PSS 버퍼에서 조직을 30 분 동안 휴식 한 다음 챔버를 배수하고 5 밀리리터의 신선한 따뜻한 폭기 HEPES-PSS 용액을 각 챔버에 첨가하십시오.
모든 근전도 챔버에 대한 힘을 0으로 만들고 마이크로미터를 시계 반대 방향으로 천천히 돌려 등록된 힘이 마우스 대동맥에 대해 원하는 최적 장력에 도달할 때까지 핀 사이의 거리를 늘립니다. 최적의 장력으로 15-20 분 동안 조직을 누른 다음 각 챔버에 5ml의 고 칼륨 용액을 추가하기 전에 챔버를 한 번 더 배출하십시오. 챔버를 다시 배수하고 고 칼륨 이온 용액에 대한 수축 반응이 고원에 도달하면 HEPES-PSS 용액으로 조직을 세 번 씻습니다.
조직을 15-20 분 동안 휴식 한 다음 혈관 수 축제 물질 인 PE로 대동맥 부분을 사전 수축시킵니다. PE 유도력이 고원에 도달하면 아세틸 콜린의 하위 최대 농도를 근압계 챔버에 추가하여 최종 농도 500 나노 몰을 달성합니다. 실험을 종료하기 전에 PE 유도력 발생을 위해 등록된 고원이 변경되지 않도록 3분 정도 기다리십시오.
각 격리 된 용기의 무결성과 생존력은 수축력 생성을 기록하여 평가되었습니다. 기록된 힘의 피크는 나중에 작용제에 반응하여 동일한 세그먼트에 대한 힘 생성을 정상화하는 데 사용되었습니다. 내피 매개 혈관 이완 측정은 평활근 매개 수축 및 힘 생성을 묘사했습니다.
PE 유도 수축이 고원에 도달했을 때, 아세틸 콜린의 복용량을 늘리면 분리 된 세그먼트에서 최대 혈관 이완이 달성되었습니다. 산화 질소 억제제 L-NAME은 사전 수축 된 대동맥에서 아세틸 콜린 유도 혈관 이완을 완전히 차단하여 아세틸 콜린이 산화 질소 생성 증가를 통해 대동맥 혈관 이완을 유도한다는 것을 나타냅니다. 또한, 대동맥 분절에서 내피 층을 제거하면 아세틸 콜린 유도 혈관 이완이 차단되어 혈관 이완에서 내피의 역할을 강조합니다.
혈관을 취급, 청소 및 해부하는 동안 부드럽게 유지하십시오. 약리학적 작용제와 억제제를 근전도 챔버에 장착된 혈관 고리를 방해하지 않도록 주의해서 추가하는 것이 중요합니다. 이 정보는 특정 혈관 층의 기능 장애를 해결하기위한 잠재적 인 치료 접근법을 탐구하기위한 실험을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.
