Demonstramos a miografia isométrica ou tensométrica como o protocolo padrão-ouro para medir a reatividade de pequenos vasos sanguíneos de resistência ou grandes condutos em uma condição fisiológica bem controlada. As medições são altamente reprodutíveis e confiáveis. A técnica é muito valiosa para permitir que os pesquisadores estudem diferentes camadas de vasos sanguíneos separadamente ou investiguem a interação entre diferentes camadas da parede dos vasos sanguíneos simultaneamente.
Demonstrando o procedimento estará Robert Folk, o especialista em laboratório de pesquisa do meu laboratório. Comece ligando o banho-maria e ajustando-o a 37 graus Celsius. Coloque dois copos rotulados adequadamente no banho-maria, um com 600 mililitros de solução HEPES-PSS e outro com 150 mililitros de solução rica em potássio.
Arejar um copo contendo 300 mililitros de solução de HEPES-PSS com gás carbógeno por pelo menos 10 minutos. Adicione 30 mililitros da solução HEPES-PSS aerada a um tubo de centrífuga de 50 mililitros, rotule adequadamente e coloque-o no gelo. Manter a solução de HEPES-PSS aerada restante no gelo para ser utilizada durante o processo de dissecção da aorta.
Ligue a unidade miográfica de quatro câmaras a 5 mililitros de solução HEPES-PSS para cada câmara miográfica e ajuste o calor para 37 graus Celsius. Deixe a solução em cada câmara ser arejada por 30 minutos e verifique se as câmaras atingiram os 37 graus Celsius desejados. Ligue o hardware e o computador de aquisição de dados do miógrafo.
Transfira a gaiola torácica excisada dos camundongos eutanasiados para uma placa de Petri revestida de elastômero de silicone transparente cheia de tampão HEPES-PSS aerado a frio e fixe-a em ambos os lados. Sob o microscópio, corte e remova suavemente o coração e a aorta anexada da caixa torácica e transfira para um prato limpo revestido de elastômero de silicone, em seguida, remova suavemente o tecido conjuntivo de gordura e o sangue coagulado da aorta. Usando uma pequena tesoura afiada, disseque e isole toda a aorta a partir da área do arco até o fundo da aorta descendente.
Corte a aorta dissecada em quatro segmentos de 2 milímetros cada. Use a mini-régua dentro do prato como referência. Em câmaras que já contenham 5 mililitros de tampão HEPES-PSS aquecido e aerado, deslize cuidadosamente cada um dos segmentos aórticos de 2 milímetros sobre os dois pinos de montagem usando pinças.
Ao colocar a câmara de volta na unidade do miógrafo, mova lentamente os pinos para longe, girando o micrômetro no sentido anti-horário para que o segmento aórtico não deslize para fora dos pinos. Devolva cada câmara miográfica à unidade e comece a arejar as câmaras a 37 graus Celsius durante 20 minutos. Escorra as câmaras e adicione 5 mililitros de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara.
Se necessário, reajuste as medições de força para ler a tensão ideal de 6 milinewtons. Descanse o tecido por mais 15 a 20 minutos. Abra o software de aquisição de dados.
Altere os números de rastreamento de 50 para 1 para 500 para 1 e pressione Iniciar. Antes de iniciar um novo experimento, certifique-se de adicionar o rótulo apropriado no software de aquisição de dados. Escorra as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mililitros de solução rica em potássio a cada câmara.
Drene as câmaras novamente assim que a resposta contrátil à solução com alto teor de potássio atingir um platô para a geração de força. Lave o tecido com a solução de HEPES-PSS três vezes. Adicione 5 mililitros de solução rica em potássio a cada câmara.
Escorra as câmaras assim que a resposta contrátil à solução rica em potássio atingir um platô para geração de força e lave o tecido três vezes com HEPES-PSS, depois descanse o tecido por 15 a 20 minutos. Pré-contraia os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor PE em uma dose submáxima. Permita que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento da tensão.
Adicionar um platô de desenvolvimento de tensão ao PE em 5 microlitros de doses crescentes de soluções de estoque de trabalho de acetilcolina em intervalos de 3 minutos para estabelecer concentrações finais de acetilcolina de 50 picomolares a 10 micromolares na câmara do miógrafo, conforme descrito no manuscrito do texto. Após completar o experimento de resposta à dose, drenar as câmaras, lavar os segmentos aórticos com solução quente e aerada de HEPES-PSS três vezes e descansar os tecidos por 30 minutos. Depois de descansar os segmentos aórticos por 30 minutos, drene as câmaras e adicione solução fresca e quente de alto teor de potássio a cada câmara, depois drene as câmaras e lave o tecido com solução HEPES-PSS quando a resposta de contração à solução rica em potássio atingir um platô F, como demonstrado anteriormente.
Pré-incubar os segmentos aórticos com L-NAME adicionando 10 microlitros da solução de trabalho preparada de 100 milimolares para avaliar a contribuição da produção de óxido nítrico para o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina observado. Sem remover o nome L, adicione a dose submáxima de EP à câmara para induzir a contração aórtica. Espere até que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento de tensão e, em seguida, adicione acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nanomolares.
Aguarde alguns minutos para registrar possíveis alterações no desenvolvimento da força até que o platô formado esteja estável. Escorra as câmaras e lave o tecido com a solução de HEPES-PSS aerada a quente três vezes. Posicione a câmara do miógrafo sob o microscópio e passe suavemente um pequeno fio através do lúmen da aorta.
Mova suavemente o fio através do lúmen por um curto período. Corte a aorta em anéis aórticos de 2 milímetros e monte esses anéis na câmara do miógrafo. Defina a tensão ideal em 6 milinewtons e deixe o tecido descansar por 30 minutos em tampão HEPES-PSS quente aerado, depois drene as câmaras e adicione 5 mililitros de solução HEPES-PSS aerada quente e fresca a cada câmara.
Zerar a força para todas as câmaras do miógrafo e girar lentamente o micrômetro no sentido anti-horário para aumentar a distância entre os pinos até que a força registrada atinja a tensão ideal desejada para a aorta do rato. Pressione o tecido por mais 15 a 20 minutos na tensão ideal, em seguida, drene as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mililitros de solução rica em potássio a cada câmara. Escorra as câmaras novamente e lave o tecido com a solução de HEPES-PSS três vezes uma vez que a resposta de contração à solução de íons com alto teor de potássio atinja um platô.
Descanse o tecido por 15 a 20 minutos e, em seguida, contraia previamente os segmentos aórticos com EP, o agente vasoconstritor. Quando a força induzida por EP atingir um platô, adicione a concentração submáxima de acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nanomolares. Aguarde 3 minutos para garantir que o platô registrado para o desenvolvimento da força induzida por EP não esteja mudando antes de terminar o experimento.
A integridade e a viabilidade de cada vaso isolado foram avaliadas por meio do registro da geração de força contrátil. O pico da força registrada foi posteriormente utilizado para normalizar a geração de força para o mesmo segmento em resposta aos agonistas. As medidas de vasorelaxamento mediadas pelo endotélio mostraram contração mediada pelo músculo liso e geração de força.
Quando a contração induzida por EP atingiu um platô, doses crescentes de acetilcolina atingiram o vasorelaxamento máximo no segmento isolado. O inibidor do óxido nítrico L-NAME bloqueou completamente o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina na aorta pré-contraída, indicando que a acetilcolina induz vasorelaxamento aórtico através do aumento da produção de óxido nítrico. Além disso, a remoção da camada endotelial dos segmentos aórticos também bloqueou o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina, ressaltando o papel do endotélio no relaxamento dos vasos sanguíneos.
Certifique-se de ser gentil ao manusear, limpar e dissecar o vaso sanguíneo. É fundamental adicionar os agonistas farmacológicos e inibidores com cuidado para não perturbar os anéis dos vasos sanguíneos montados nas câmaras do miógrafo. As informações podem ajudar a projetar experimentos para explorar possíveis abordagens terapêuticas para abordar a disfunção das camadas de um vaso sanguíneo específico.
