Este método presenta una manera de crear andamios derivados del tejido nativo que se puede utilizar para la regeneración del cartílago. La principal ventaja de esta técnica es que los componentes del cartílago nativo se conservan en los andamios que pueden promover la formación y regeneración del cartílago in vitro e in vivo. Aunque este método utiliza cartílago de las articulaciones de la asfixia equina, el cartílago de cualquier otra articulación se puede utilizar también.
Para comenzar, obtener una articulación cadavérica intacta para el aislamiento del cartílago y eliminar el exceso de grasa de la piel y el tejido muscular como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña. A continuación, defina la ubicación donde se articula la articulación realizando la inflexión de extensión de la articulación. Haga una incisión horizontal para llegar a la cavidad articular.
A continuación, haga una incisión vertical para abrir el área de la articulación. La cavidad articular está llena de líquido sinovial que probablemente gotea de la cavidad al realizar la incisión correcta. Continúe abriendo la articulación por completo mediante la eliminación de grasa excesiva, músculos y tendones, y cortando a través de los tendones que mantienen la articulación unida.
Inspeccione cuidadosamente el cartílago en busca de cualquier daño macroscópico. Si el cartílago articular no tiene un aspecto liso más brillante o si hay evidencia, ampollas, hendiduras o defectos, deseche el cartílago y comience de nuevo. Usa un bisturí estéril para extraer el cartílago del hueso.
Corte todo el camino hasta el hueso subcondral para eliminar el cartílago de la zona profunda. Recoger las rodajas de cartílago retiradas en tubos de 50 mililitros que contienen solución de lavado de cartílago previamente preparada. Mientras se procesa, gotee regularmente la solución de lavado de cartílago en el cartílago para evitar que el cartílago se seque.
Después de recoger el cartílago de todas las áreas de interés, congela las rodajas de cartílago en nitrógeno líquido durante cinco minutos. Luego transfiera las rodajas de cartílago en tubos de 50 mililitros e inmediatamente coloque las rodajas congeladas en un secador de congelación. Liofilizar las rodajas de cartílago durante 24 horas con el secador de congelación.
Cuando haya terminado, guarde las rodajas de cartílago liofilización en un lugar seco a temperatura ambiente. Para el procesamiento manual, precalar un mortero y peste con nitrógeno líquido, luego coloque las rodajas de cartílago liofilizado en el mortero y sumerjalas y nitrógeno líquido. Moler directamente las muestras a mano durante aproximadamente 45 minutos hasta que estén suficientemente pulverizadas.
Alternativamente, para moler las muestras automáticamente utilizando una fresadora, comience por preenfriar el compartimiento de molienda de la fresadora mediante la adición de nitrógeno líquido. A continuación, agregue las rodajas de cartílago liofilizado y mida la muestra a su velocidad preestablecida durante unos segundos hasta un minuto. Asegúrese de que todas las partículas estén molidas y de que no haya partículas en la parte inferior del compartimiento de molienda.
Por último, siga la técnica de descelularización descrita en el protocolo de texto adjunto antes de formar andamios. Transfiera las partículas de cartílago con una pequeña etiqueta a un molde de plástico cilíndrico. Presione todas las burbujas de aire hacia fuera para evitar las cavidades en el andamio y llenar el molde por completo.
Para evitar caries en los andamios, asegúrese de que las burbujas de aire se presionan hacia fuera mientras llena el molde con partículas de cartílago. Después de la formación, congelar el molde durante 10 minutos a menos 20 grados Centígrados. Luego liofilizar los andamios de cartílago dentro del molde durante 24 horas en un secador de congelación.
Después de la liofilización, retire cuidadosamente el andamio del molde. Coloque el andamio debajo de una luz UV de longitud de onda de 365 nanómetros y úntelo durante la noche. Forme discos de andamios cortando andamios esterilizados en rodajas de tres milímetros de espesor.
A continuación, transfiera los andamios a pozos separados de una placa de seis pozos. Añadir un mililitro de Chondrocyte Expansion Medium en la parte superior de los andamios y dejar que se rehidraten durante 30 minutos. Mientras los andamios se rehidratan, prepare las células y la pipeta 50 microlitros de la suspensión celular preparada en la parte superior del andamio pre remojo.
Luego incuba el andamio durante una hora a 37 grados Centígrados. Cuando utilice condrocitos, asegúrese de que no se han expandido más allá del primer pasaje para minimizar el número de células diferenciadas. Después de una hora, devuelva la placa a la campana de cultivo y gire cuidadosamente el andamio.
Pipetear los 50 microlitros restantes de suspensión celular en el andamio e incubar durante otra hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, añadir tres mililitros de medio a los pocósitos con andamios. Evite pipetear el medio directamente sobre los andamios y manipule la placa de cultivo suavemente para evitar el desprendimiento de las células.
Devuelva la placa a la incubadora y a los andamios cedidos de células de cultivo a 37 grados centígrados. Se ha utilizado una combinación de tinción historlógica y cuantificación del ADN para demostrar que los métodos presentados en este artículo dan como resultado una descelularización suficiente del andamio del cartílago. Se encontró que los andamios resultantes no contenían células junto con niveles indetectables de ADN.
También carecen de glicosaminoglicanos y son ricos en colágeno II.Aquí, la formación de neo matriz se observa en el andamio cedido con células madre mesenquimales que se cultivaron durante cuatro semanas. La formación de glicosaminoglicanos es abundante después de cuatro semanas. Después de intentar este procedimiento, es importante examinar si la descelularización se ha realizado correctamente, antes de usarla en cualquier aplicación.
Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis bioquímico adicional como el analizador de manchas occidentales para responder preguntas específicas sobre la presencia de otros componentes como factores de crecimiento. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran estrategias para la regeneración del cartílago utilizando tejido descelularizado de fuentes alogénicas y singéneas. Siempre se deben tomar precauciones como el uso de una bata de laboratorio y guantes.
