La irradiación gamma es un tratamiento ampliamente utilizado para el cáncer colorrectal. Y aunque es terapéuticamente eficaz, tiene efectos negativos en el tracto gastrointestinal. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la activación, diferenciación y migración de células durante la regeneración después de una lesión por radiación.
Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Es importante destacar que este modelo permite rastrear el destino de las células intestinales después de una lesión y, por lo tanto, proporciona una mejor comprensión de la capacidad regenerativa de una subpoblación celular específica. Esta técnica puede emplear distintos modelos animales de rastreo de linaje para estudiar el comportamiento en tiempo real y la interacción de varias subpoblaciones de células después de la lesión.
Las modificaciones menores a este protocolo deberían permitir la investigación de las relaciones entre la microbiota y diferentes poblaciones de células epiteliales, estromales e inmunes tras una lesión por radiación. Para comenzar, resuspenda el polvo de tamoxifeno en aceite de maíz estéril a una concentración de 30 microgramos por microlitro. Sonicate durante tres minutos en ciclos de encendido y apagado de 30 segundos con una amplitud del 60%.
Mezclar por rotación en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, prepare EdU agregando DMSO estéril al polvo de EdU. Agregue 1/5 del volumen total y agregue lentamente el volumen restante de agua ultrapura estéril.
Cuando esté completamente disuelto, alícuota y almacenar a 20 grados centígrados. Prepare reactivos para la recolección y fijación de tejidos, como etanol al 70% en agua, DPBS enfriado a cuatro grados centígrados, tampón fijador de Bouin y formalina tamponada al 10%. A continuación, prepare el equipo necesario, como un kit de disección de ratones, placas de Petri, una aguja de sonda de calibre 16 conectada a una jeringa de 10 mililitros y casetes histológicos.
Dos días antes de la exposición a la irradiación gamma, prepare a los animales de experimentación para la inyección de tamoxifeno. Pese cada animal y calcule la dosis requerida. Desinfectar la zona abdominal con etanol al 70%.
Luego, administre una dosis única de tamoxifeno por vía intraperitoneal usando una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro para inducir la recombinación mediada por Cre. Observe a los animales durante las próximas 48 horas para excluir la posible toxicidad del tamoxifeno. Después de 48 horas, transfiera a los animales a la sala de irradiación.
Desinfecte la cámara de muestras en el irradiador gamma con solución de etanol al 70%. Coloque la estera absorbente y los animales dentro de la cámara de muestra. Coloque la tapa y cierre la cámara.
Programe el irradiador gamma para exponer a los animales a 12 irradiación corporal total gris. Luego, gire la tecla a la posición inicial y presione inicio para iniciar la exposición. Salga de la habitación para el tiempo de exposición activa.
Después de que haya transcurrido el tiempo preestablecido, la máquina se detendrá automáticamente y comenzará a emitir pitidos. Apague la máquina girando la llave en la posición de parada. Abra la cámara de muestras y retire la tapa.
Transfiera los animales a la jaula y desinfecte la cámara de muestras con etanol al 70%. Transfiera a los animales de regreso a la sala de alojamiento convencional y observe su condición después del tratamiento. Controle el peso de los animales todos los días.
Tres horas antes de la eutanasia planificada, desinfecte el área abdominal e inyecte a los ratones por vía intraperitoneal con 100 microlitros de solución madre de EdU con una jeringa de insulina de calibre 28. Después de la eutanasia del animal, recoja los intestinos proximales en diferentes puntos de tiempo después de la irradiación. Diseccionar la parte proximal del intestino delgado y eliminar los tejidos adheridos.
Enjuague el tejido con DPBS frío con una aguja de alimentación recta de calibre 16 conectada a una jeringa de 10 mililitros y fije el tejido con el tampón fijador de Bouin. Corte los intestinos abiertos longitudinalmente y enrolle los intestinos proximales utilizando la técnica de rollo suizo. Coloque los tejidos en un casete histológico en un recipiente con formalina tamponada al 10% e incube durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente.
Después de la incubación, transfiera los casetes histológicos al etanol al 70% e incruste el tejido en parafina. Después de la incrustación, coloque los casetes histológicos en hielo durante al menos una hora. Luego, corte secciones horizontales de cinco micras de espesor con un micrótomo.
Transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 grados centígrados y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente. Las imágenes de hematoxilina y eosina de muestras del intestino delgado mostraron un epitelio intestinal homeostático en hora cero, seguido de la pérdida de células dentro de los compartimentos de la cripta durante la fase apoptótica.
Esto fue seguido por la fase regenerativa en la que las células altamente proliferativas poblaron las criptas, lo que llevó a la fase de normalización en el día siete. El rastreo de linaje por EYFP mostró que durante la homeostasis, las células que se originan a partir de células madre de reserva positivas Bmi1 se restringieron a las posiciones más cuatro a más seis dentro de las criptas. La tinción de EdU y Ki-67 mostró homeostasis intestinal normal en ratones irradiados simuladamente, que se extiende desde las células madre activas a través de la zona de amplificación del tránsito.
Durante la fase apoptótica, el número de células positivas para EYFP disminuyó, acompañado de una pérdida de células proliferativas causada por el daño por radiación. En la fase regenerativa, se observó la activación de células madre de reserva y la rápida proliferación de células positivas para Bmi1. Una mayor proliferación y migración restauró la integridad del epitelio intestinal.
La tinción TUNEL mostró que las células apoptóticas están ausentes durante la homeostasis. Se observó un aumento en la tinción de TUNEL al final de la fase apoptótica. Durante la fase regenerativa, la tinción TUNEL disminuyó constantemente dentro de las criptas regeneradoras y estuvo casi ausente cuando las criptas se normalizaron.
Esta técnica se puede combinar con la secuenciación de ARN, la secuenciación de ARN unicelular, la clasificación celular activada por fluorescencia o el análisis proteómico para obtener un conocimiento más profundo sobre el papel de linajes celulares específicos durante la regeneración intestinal después de una lesión. Los investigadores pueden investigar las interacciones entre la microbiota y las poblaciones de células epiteliales, estromales e inmunes en la regeneración intestinal para ampliar la comprensión de la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.
