L’irradiation gamma est un traitement largement utilisé pour le cancer colorectal. Et bien qu’il soit thérapeutiquement efficace, il a des effets négatifs sur le tractus gastro-intestinal. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération après une lésion radiologique.
Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il est important de noter que ce modèle permet de suivre le devenir des cellules intestinales à la suite d’une blessure et permet ainsi de mieux comprendre la capacité de régénération d’une sous-population cellulaire spécifique. Cette technique peut utiliser des modèles animaux distincts de traçage de lignée pour étudier le comportement en temps réel et l’interaction de diverses sous-populations de cellules après une blessure.
Des modifications mineures de ce protocole devraient permettre d’étudier les relations entre le microbiote et différentes populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires en cas de lésion radiologique. Pour commencer, remettez en suspension la poudre de tamoxifène dans de l’huile de maïs stérile à une concentration de 30 microgrammes par microlitre. Sonicate pendant trois minutes en 30 secondes cycles marche-arrêt avec une amplitude de 60%.
Mélanger par rotation dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Ensuite, préparez EdU en ajoutant du DMSO stérile à la poudre EdU. Ajouter 1/5 du volume total et ajouter lentement le volume restant d’eau ultrapure stérile.
Une fois complètement dissous, aliquote et conserver à 20 degrés Celsius. Préparer des réactifs pour la collecte et la fixation des tissus, tels que l’éthanol à 70 % dans l’eau, le DPBS refroidi à quatre degrés Celsius, le tampon fixateur de Bouin et le formol tamponné à 10 %. Ensuite, préparez l’équipement nécessaire, tel qu’un kit de dissection de souris, des boîtes de Petri, une aiguille de gavage de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et des cassettes histologiques.
Deux jours avant l’exposition à l’irradiation gamma, préparer les animaux de laboratoire à l’injection de tamoxifène. Pesez chaque animal et calculez la dose requise. Désinfectez la région abdominale avec de l’éthanol à 70%.
Ensuite, administrer une dose unique de tamoxifène par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de calibre 27 fixée à une seringue d’un millilitre pour induire une recombinaison médiée par Cre. Observez les animaux pendant les prochaines 48 heures pour exclure toute toxicité potentielle du tamoxifène. Après 48 heures, transférez les animaux dans la salle d’irradiation.
Désinfectez la chambre d’échantillonnage dans l’irradiateur gamma avec une solution d’éthanol à 70%. Placez le tapis absorbant et les animaux à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage. Placez le couvercle et fermez la chambre.
Programmez l’irradiateur gamma pour exposer les animaux à 12 gris d’irradiation corporelle totale. Ensuite, tournez la clé sur la position de départ et appuyez sur Démarrer pour lancer l’exposition. Quittez la pièce pour un temps d’exposition actif.
Une fois le temps prédéfini écoulé, la machine s’arrête automatiquement et commence à émettre un bip. Éteignez la machine en tournant la clé en position d’arrêt. Ouvrez la chambre d’échantillonnage et retirez le couvercle.
Transférer les animaux dans la cage et désinfecter la chambre d’échantillonnage avec de l’éthanol à 70%. Transférez les animaux dans la salle de logement conventionnelle et observez leur état après le traitement. Surveillez le poids des animaux tous les jours.
Trois heures avant l’euthanasie prévue, désinfectez la région abdominale et injectez aux souris par voie intrapéritonéale 100 microlitres de solution mère d’EdU à l’aide d’une seringue à insuline de calibre 28. Après avoir euthanasié l’animal, prélever les intestins proximaux à différents moments après l’irradiation. Disséquez la partie proximale de l’intestin grêle et retirez les tissus attachés.
Rincez le tissu avec du DPBS froid à l’aide d’une aiguille d’alimentation droite de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et fixez le tissu avec le tampon fixateur de Bouin. Coupez les intestins ouverts longitudinalement et roulez les intestins proximaux en utilisant la technique Swiss-roll. Placez les tissus dans une cassette histologique dans un récipient contenant du formol tamponné à 10% et incuber pendant 24 à 48 heures à température ambiante.
Après l’incubation, transférer les cassettes histologiques à 70% d’éthanol et incorporer le tissu dans de la paraffine. Après l’intégration, placez les cassettes histologiques sur de la glace pendant au moins une heure. Ensuite, coupez des sections horizontales de cinq microns d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
Transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 degrés Celsius et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante. Les images d’hématoxyline et d’éosine d’échantillons d’intestin grêle ont montré un épithélium intestinal homéostatique à zéro heure, suivi de la perte de cellules dans les compartiments cryptiques pendant la phase apoptotique.
Cela a été suivi par la phase de régénération dans laquelle les cellules hautement prolifératives ont peuplé les cryptes, conduisant à la phase de normalisation au septième jour. Le traçage de la lignée par EYFP a montré que pendant l’homéostasie, les cellules provenant des cellules souches de réserve positive Bmi1 étaient limitées aux positions plus quatre à plus six dans les cryptes. La coloration EdU et Ki-67 a montré une homéostasie intestinale normale chez des souris irradiées simulées, s’étendant des cellules souches actives à travers la zone amplifiant le transit.
Au cours de la phase apoptotique, le nombre de cellules EYFP-positives a diminué, accompagné d’une perte de cellules prolifératives causée par les dommages causés par les radiations. Dans la phase de régénération, l’activation des cellules souches de réserve et la prolifération rapide des cellules Bmi1-positives ont été observées. La poursuite de la prolifération et de la migration a restauré l’intégrité de l’épithélium intestinal.
La coloration TUNEL a montré que les cellules apoptotiques sont absentes pendant l’homéostasie. Une augmentation de la coloration TUNEL a été observée tard dans la phase apoptotique. Au cours de la phase de régénération, la coloration TUNEL a diminué régulièrement dans les cryptes en régénération et était presque absente lorsque les cryptes se sont normalisées.
Cette technique peut être combinée avec le séquençage de l’ARN, le séquençage de l’ARN unicellulaire, le tri cellulaire activé par fluorescence ou l’analyse protéomique pour glaner des connaissances plus approfondies sur le rôle de lignées cellulaires spécifiques pendant la régénération intestinale à la suite d’une blessure. Les chercheurs peuvent étudier les interactions entre le microbiote et les populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires dans la régénération intestinale afin d’élargir la compréhension de la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.
