Гамма-облучение является широко используемым методом лечения колоректального рака. И хотя он терапевтически эффективен, он оказывает негативное влияние на желудочно-кишечный тракт. Представленный протокол описывает эффективный метод изучения активации, дифференцировки и миграции клеток при регенерации после лучевого поражения.
Этот протокол описывает надежную и воспроизводимую модель лучевого поражения. Важно отметить, что эта модель позволяет отслеживать судьбу клеток кишечника после травмы и, таким образом, обеспечивает лучшее понимание регенеративной способности конкретной клеточной субпопуляции. Этот метод может использовать различные модели животных, отслеживающие родословную, для изучения поведения в реальном времени и взаимодействия различных субпопуляций клеток после травмы.
Незначительные изменения в этом протоколе должны позволить исследовать взаимосвязь между микробиотой и различными популяциями эпителиальных, стромальных и иммунных клеток при лучевом поражении. Для начала ресуспендируйте порошок тамоксифена в стерильном кукурузном масле в концентрации 30 мкг на микролитр. Ультразвук в течение трех минут в течение 30 секунд циклов включения-выключения с амплитудой 60%.
Перемешайте вращением в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. Затем приготовьте EdU, добавив стерильный ДМСО в порошок EdU. Добавьте 1/5 от общего объема, а оставшийся объем медленно добавьте стерильную сверхчистую воду.
При полном растворении аликвотировать и хранить при температуре 20 градусов Цельсия. Приготовьте реагенты для сбора и фиксации тканей, такие как 70% этанол в воде, DPBS, охлажденный до четырех градусов Цельсия, фиксирующий буфер Буэна и 10%-ный буферный формалин. Затем подготовьте необходимое оборудование, такое как набор для вскрытия мышей, чашки Петри, игла для зонда 16-го калибра, прикрепленная к 10-миллилитровому шприцу, и гистологические кассеты.
За двое суток до облучения гамма-облучением подготовят подопытных животных к инъекции тамоксифена. Взвесьте каждое животное и рассчитайте необходимую дозировку. Продезинфицируйте область живота 70% этанолом.
Затем введите однократную дозу тамоксифена внутрибрюшинно с помощью иглы 27-го калибра, прикрепленной к шприцу объемом один миллилитр, чтобы вызвать рекомбинацию, опосредованную Cre. Наблюдайте за животными в течение следующих 48 часов, чтобы исключить потенциальную токсичность тамоксифена. Через 48 часов переведите животных в комнату облучения.
Продезинфицируйте камеру для образцов в гамма-облучателе 70%-ным раствором этанола. Поместите абсорбирующий коврик и животных в камеру для образцов. Закройте крышку и закройте камеру.
Запрограммируйте гамма-облучатель так, чтобы он подвергал животных облучению всего тела 12 серыми. Затем поверните клавишу в исходное положение и нажмите «Пуск», чтобы начать экспозицию. Оставьте помещение на время активного воздействия.
По истечении заданного времени машина автоматически остановится и начнет издавать звуковой сигнал. Выключите машину, повернув ключ в стоп-положение. Откройте камеру для образцов и снимите крышку.
Перенесите животных в клетку и продезинфицируйте камеру для образцов 70% этанолом. Переведите животных обратно в обычную комнату содержания и наблюдайте за их состоянием после лечения. Следите за весом животных каждый день.
За три часа до запланированной эвтаназии продезинфицируйте область живота и введите мышам внутрибрюшинно 100 микролитров исходного раствора EdU с помощью инсулинового шприца 28-го калибра. После эвтаназии животного собирают проксимальный отдел кишечника в разные моменты времени после облучения. Рассекают проксимальную часть тонкой кишки и удаляют прикрепленные ткани.
Промойте ткань холодным DPBS с помощью прямой иглы для кормления 16-го калибра, прикрепленной к 10-миллилитровому шприцу, и зафиксируйте ткань фиксирующим буфером Буэна. Разрежьте кишки, открытые в продольном направлении, и сверните проксимальные кишки, используя технику швейцарского ролла. Поместите ткани в гистологическую кассету в контейнер с 10%-ным буферным формалином и инкубируйте его в течение 24-48 часов при комнатной температуре.
После инкубации переведите гистологические кассеты на 70%-ный этанол, а ткань погрузите в парафин. После заделки поместите гистологические кассеты на лед не менее чем на один час. Затем вырежьте горизонтальные срезы толщиной пять микрон с помощью микротома.
Перенесите срезы тканей на водяную баню, разогретую до 45 градусов по Цельсию, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания. Изображения гематоксилина и эозина образцов тонкой кишки показали гомеостатический кишечный эпителий в нулевом часе с последующей потерей клеток в компартментах крипт во время апоптотической фазы.
За этим последовала регенеративная фаза, в которой высокопролиферативные клетки заполнили крипты, что привело к фазе нормализации к седьмому дню. Отслеживание происхождения с помощью EYFP показало, что во время гомеостаза клетки, происходящие из стволовых клеток с положительным резервом Bmi1, были ограничены плюс-четырьмя-шестью позициями в криптах. Окрашивание EdU и Ki-67 показало нормальный гомеостаз кишечника у фиктивно облученных мышей, простирающийся от активных стволовых клеток через транзитно-амплифицирующую зону.
Во время апоптотической фазы количество EYFP-положительных клеток уменьшалось, что сопровождалось потерей пролиферативных клеток, вызванной радиационным повреждением. В регенеративной фазе наблюдалась активация резервных стволовых клеток и быстрая пролиферация Bmi1-положительных клеток. Дальнейшая пролиферация и миграция восстановили целостность кишечного эпителия.
Окрашивание TUNEL показало, что апоптотические клетки отсутствуют во время гомеостаза. Увеличение окрашивания TUNEL наблюдалось в конце апоптотической фазы. Во время регенеративной фазы окрашивание TUNEL неуклонно уменьшалось в регенерирующих криптах и почти отсутствовало, когда крипты нормализовались.
Этот метод можно комбинировать с секвенированием РНК, секвенированием одноклеточной РНК, сортировкой клеток, активируемой флуоресценцией, или протеомным анализом, чтобы получить более глубокие знания о роли конкретных клеточных линий во время регенерации кишечника после травмы. Исследователи могут исследовать взаимодействие между микробиотой и популяциями эпителиальных, стромальных и иммунных клеток в регенерации кишечника, чтобы расширить понимание регенеративной способности кишечного эпителия.
