L'irradiazione gamma è un trattamento ampiamente usato per il cancro del colon-retto. E mentre è terapeuticamente efficace, ha effetti negativi sul tratto gastrointestinale. Il protocollo presentato descrive un metodo efficiente per studiare l'attivazione, la differenziazione e la migrazione delle cellule durante la rigenerazione dopo lesioni da radiazioni.
Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. È importante sottolineare che questo modello consente di tracciare il destino delle cellule intestinali dopo la lesione e quindi fornisce una migliore comprensione della capacità rigenerativa di specifiche sottopopolazioni cellulari. Questa tecnica può impiegare modelli animali distinti per studiare il comportamento in tempo reale e l'interazione di varie sottopopolazioni di cellule post-lesione.
Piccole modifiche a questo protocollo dovrebbero consentire lo studio delle relazioni tra microbiota e diverse popolazioni di cellule epiteliali, stromali e immunitarie in caso di danno da radiazioni. Per iniziare, risospendere la polvere di tamoxifene in olio di mais sterile ad una concentrazione di 30 microgrammi per microlitro. Sonica per tre minuti in cicli on-off di 30 secondi con un'ampiezza del 60%.
Mescolare ruotando al buio per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, preparare EdU aggiungendo DMSO sterile alla polvere EdU. Aggiungere 1/5 del volume totale e aggiungere lentamente il volume rimanente di acqua ultrapura sterile.
Quando completamente sciolto, aliquote e conservare a 20 gradi Celsius. Preparare i reagenti per la raccolta e la fissazione dei tessuti, come il 70% di etanolo in acqua, DPBS raffreddato a quattro gradi Celsius, tampone fissativo di Bouin e formalina tamponata al 10%. Quindi, preparare l'attrezzatura necessaria, come un kit di dissezione dei topi, piastre di Petri, un ago da gavage calibro 16 collegato a una siringa da 10 millilitri e cassette istologiche.
Due giorni prima dell'esposizione all'irradiazione gamma, preparare gli animali da esperimento per l'iniezione di tamoxifene. Pesare ogni animale e calcolare il dosaggio richiesto. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70%.
Quindi, somministrare una singola dose di tamoxifene per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27 gauge collegato a una siringa da un millilitro per indurre la ricombinazione mediata da Cre. Osservare gli animali per le prossime 48 ore per escludere la potenziale tossicità del tamoxifene. Dopo 48 ore, trasferire gli animali nella stanza di irradiazione.
Disinfettare la camera del campione nell'irradiatore gamma con una soluzione di etanolo al 70%. Posizionare il tappetino assorbente e gli animali all'interno della camera del campione. Posizionare il coperchio e chiudere la camera.
Programmare l'irradiatore gamma per esporre gli animali a 12 irradiazioni grigie del corpo totale. Quindi, ruotare la chiave sulla posizione iniziale e premere start per avviare l'esposizione. Lasciare la stanza per il tempo di esposizione attiva.
Trascorso il tempo preimpostato, la macchina si arresterà automaticamente e inizierà a emettere un segnale acustico. Spegnere la macchina ruotando la chiave nella posizione di arresto. Aprire la camera del campione e togliere il coperchio.
Trasferire gli animali nella gabbia e disinfettare la camera del campione con etanolo al 70%. Trasferire gli animali nella stanza di stabulazione convenzionale e osservare le loro condizioni dopo il trattamento. Monitorare il peso degli animali ogni giorno.
Tre ore prima dell'eutanasia pianificata, disinfettare l'area addominale e iniettare i topi per via intraperitoneale con 100 microlitri di soluzione madre di EdU utilizzando una siringa da insulina da 28 gauge. Dopo l'eutanasia dell'animale, raccogliere gli intestini prossimali in diversi punti temporali post-irradiazione. Sezionare la parte prossimale dell'intestino tenue e rimuovere i tessuti attaccati.
Lavare il tessuto con DPBS freddo utilizzando un ago di alimentazione dritto calibro 16 collegato a una siringa da 10 millilitri e fissare il tessuto con il tampone fissativo di Bouin. Tagliare l'intestino aperto longitudinalmente e arrotolare l'intestino prossimale usando la tecnica Swiss-roll. Mettere i tessuti in una cassetta istologica in un contenitore con formalina tamponata al 10% e incubarlo per 24-48 ore a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, trasferire le cassette istologiche al 70% di etanolo e incorporare il tessuto in paraffina. Dopo l'incorporazione, posizionare le cassette istologiche sul ghiaccio per almeno un'ora. Quindi, tagliare sezioni orizzontali spesse cinque micron usando un microtomo.
Trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldata fino a 45 gradi Celsius e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente. Le immagini di ematossilina ed eosina di campioni di intestino tenue hanno mostrato un epitelio intestinale omeostatico all'ora zero, seguito dalla perdita di cellule all'interno dei compartimenti della cripta durante la fase apoptotica.
Questo è stato seguito dalla fase rigenerativa in cui cellule altamente proliferative popolavano le cripte, portando alla fase di normalizzazione entro il settimo giorno. Il tracciamento del lignaggio da parte dell'EYFP ha mostrato che durante l'omeostasi, le cellule provenienti da cellule staminali di riserva positive al Bmi1 erano limitate alle posizioni da quattro a più sei all'interno delle cripte. La colorazione di EdU e Ki-67 ha mostrato una normale omeostasi intestinale nei topi irradiati fittizi, che si estende dalle cellule staminali attive attraverso la zona di amplificazione del transito.
Durante la fase apoptotica, il numero di cellule EYFP-positive è diminuito, accompagnato da una perdita di cellule proliferative causata da danni da radiazioni. Nella fase rigenerativa è stata osservata l'attivazione delle cellule staminali di riserva e la rapida proliferazione delle cellule Bmi1-positive. L'ulteriore proliferazione e migrazione ha ripristinato l'integrità dell'epitelio intestinale.
La colorazione TUNEL ha mostrato che le cellule apoptotiche sono assenti durante l'omeostasi. Un aumento della colorazione TUNEL è stato osservato verso la fine della fase apoptotica. Durante la fase rigenerativa, la colorazione TUNEL è diminuita costantemente all'interno delle cripte rigeneranti ed è stata quasi assente quando le cripte si sono normalizzate.
Questa tecnica può essere combinata con il sequenziamento dell'RNA, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o l'analisi proteomica per raccogliere conoscenze più approfondite sul ruolo di specifiche linee cellulari durante la rigenerazione intestinale dopo la lesione. I ricercatori possono studiare le interazioni tra microbiota e popolazioni di cellule epiteliali, stromale e immunitarie nella rigenerazione intestinale per espandere la comprensione della capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.
