ガンマ線照射は、結腸直腸癌の広く使用されている治療法です。そしてそれは治療的に効果的ですが、それは胃腸管に悪影響を及ぼします。提示されたプロトコルは、放射線損傷後の再生中の細胞の活性化、分化、および遊走を研究するための効率的な方法を説明しています。
このプロトコルは、堅牢で再現性のある放射線障害モデルを記述します。重要なことに、このモデルは、損傷後の腸細胞の運命を追跡することを可能にし、したがって、特定の細胞亜集団の再生能力のより良い理解を提供する。この手法では、異なる系統追跡動物モデルを使用して、損傷後の細胞のさまざまな亜集団のリアルタイムの行動と相互作用を研究することができます。
このプロトコルを少し変更することで、微生物叢と放射線損傷時のさまざまな上皮、間質、および免疫細胞集団との関係を調査できるはずです。はじめに、タモキシフェン粉末を滅菌コーン油にマイクロリットルあたり30マイクログラムの濃度で再懸濁します。60%の振幅で30秒のオンオフサイクルで3分間超音波処理します。
室温で1時間暗所で回転させて混合する。次に、滅菌DMSOをEdU粉末に添加してEdUを調製する。全量の1/5を加え、残りの滅菌超純水をゆっくりと加えます。
完全に溶解したら、分注して摂氏20度で保存します。水中の70%エタノール、摂氏4度に冷却したDPBS、ブアンの固定液バッファー、10%緩衝ホルマリンなど、組織を採取および固定するための試薬を準備します。次に、マウス解剖キット、ペトリ皿、10ミリリットルの注射器に取り付けられた16ゲージの経管針、組織学的カセットなどの必要な機器を準備します。
ガンマ線照射の2日前に、タモキシフェン注射のために実験動物を準備する。各動物の体重を量り、必要な投与量を計算します。腹部を70%エタノールで消毒します。
次に、1ミリリットルの注射器に取り付けられた27ゲージの針を使用してタモキシフェンの単回投与を腹腔内に投与し、Creを介した組換えを誘発します。潜在的なタモキシフェン毒性を排除するために、次の48時間動物を観察します。.48時間後、動物を照射室に移します。
ガンマ線照射器内のサンプルチャンバーを70%エタノール溶液で消毒します。吸収マットと動物をサンプルチャンバー内に置きます。蓋をして、チャンバーを閉じます。
動物を12グレイ全身照射にさらすようにガンマ線照射器をプログラムします。次に、キーを開始位置に回し、開始を押して露出を開始します。アクティブな露出時間のために部屋を出てください。
プリセット時間が経過すると、マシンは自動的に停止し、ビープ音が鳴り始めます。キーを停止位置に回して、機械の電源を切ります。サンプルチャンバーを開き、蓋を外します。
動物をケージに移し、サンプルチャンバーを70%エタノールで消毒します。動物を従来の飼育室に戻し、処理後の状態を観察します。毎日動物の体重を監視します。
計画された安楽死の3時間前に、腹部を消毒し、28ゲージのインスリン注射器を使用して100マイクロリットルのEdUストック溶液をマウスの腹腔内に注射します。動物を安楽死させた後、照射後の異なる時点で近位腸を採取する。小腸の近位部を解剖し、付着した組織を取り除きます。
10ミリリットルの注射器に取り付けられた16ゲージのストレート栄養針を使用して、冷たいDPBSで組織を洗い流し、Bouinの固定バッファーで組織を固定します。腸を縦方向に切り開き、スイスロール技術を使用して近位腸を転がします。組織を10%緩衝ホルマリンを含む容器内の組織学的カセットに入れ、室温で24〜48時間インキュベートします。
インキュベーション後、組織学的カセットを70%エタノールに移し、組織をパラフィンに包埋します。包埋後、組織学的カセットを少なくとも1時間氷上に置く。次に、ミクロトームを使用して厚さ5ミクロンの水平断面を切り取ります。
組織切片を摂氏45度まで温めた水浴に移し、切片を帯電したスライドの上に置きます。スライドを室温で一晩ラックに置いて乾かします。小腸検体のヘマトキシリンおよびエオジン画像は、ゼロ時間で恒常性腸上皮を示し、その後、アポトーシス期に陰窩コンパートメント内の細胞が失われた。
これに続いて、高度に増殖する細胞が陰窩に生息する再生段階が続き、7日目までに正常化段階に至りました。EYFPによる系統追跡は、恒常性の間、Bmi1陽性予備幹細胞に由来する細胞が陰窩内のプラス4〜プラス6の位置に制限されることを示した。EdUおよびKi−67染色は、偽照射マウスにおいて正常な腸恒常性を示し、活性幹細胞からトランジット増幅ゾーンを通って拡大した。
アポトーシス期には、EYFP陽性細胞の数が減少し、放射線障害によって引き起こされる増殖細胞の喪失を伴いました。再生段階では、予備幹細胞の活性化とBmi1陽性細胞の急速な増殖が観察されました。さらなる増殖および移動は腸上皮の完全性を回復させた。
TUNEL染色は、恒常性の間にアポトーシス細胞が存在しないことを示した。TUNEL染色の増加は、アポトーシス期の後半に観察されました。再生段階では、TUNEL染色は再生陰窩内で着実に減少し、陰窩が正常化するとほとんど存在しませんでした。
この手法は、RNAシーケンシング、シングルセルRNAシーケンシング、蛍光活性化セルソーティング、またはプロテオミクス解析と組み合わせて、損傷後の腸管再生における特定の細胞系譜の役割に関するより深い知識を集めることができます。研究者らは、腸の再生における微生物叢と上皮、間質、および免疫細胞集団との相互作用を調査して、腸上皮の再生能力の理解を広げることができます。
