Describimos las técnicas necesarias para el modelo de trasplante de piel de xenoinjerto humano, una herramienta importante para la manipulación de vías inmunes y no inmunes en tejidos humanos in vivo. Esta técnica recapitula mejor la fisiología de la piel humana que los métodos in vitro, lo que permite la manipulación experimental preclínica in vivo. Los trasplantes de piel de xenoinjerto se pueden utilizar para pruebas preclínicas de compuestos dirigidos a la inflamación de la piel humana in vivo.
Vendar ratones puede ser particularmente desafiante, por lo que aconsejamos practicar el proceso de vendaje en ratones sanos anestesiados antes de realizar cirugías. Para comenzar, prepárese para dermatomar la muestra de piel humana en una campana de cultivo de tejido de presión negativa esterilizada en una placa de disección esterilizada. Coloque la muestra de piel con la epidermis boca arriba en la tabla de disección y limpie la epidermis con una almohadilla estéril de preparación de alcohol seguida de PBS.
Ahora use un pin en T de disección de 1.5 pulgadas para fijar el borde más cercano de la piel. Luego dermatomeme la muestra de piel a 400 micrómetros de espesor y aplique una presión constante mientras corta hacia adelante en un ángulo de 30 a 45 grados. Coloque una gasa estéril empapada en PBS estéril en el fondo de la placa de Petri y coloque la piel con el lado de la epidermis hacia arriba sobre la gasa húmeda.
Selle y cubra los bordes de la placa con una película de sellado semitransparente para asegurarse de que la muestra no esté contaminada y almacene la muestra a cuatro grados centígrados antes del injerto. Prepare los instrumentos estériles y la estación quirúrgica para el injerto y use toallas de papel esterilizadas en autoclave como superficies estériles para la colocación de instrumentos y ratones. Después de la inducción de la anestesia, transfiera el ratón a una almohadilla térmica u otra fuente de calor y administre el ungüento oftálmico frotando una pequeña gota de ungüento en el ojo con un dedo enguantado.
Pellizque la piel e inyecte analgésicos por vía subcutánea en un ángulo paralelo al cuerpo. Después de levantar el ratón por la cola, exponga el abdomen e inyecte 100 microgramos por 100 microlitros de anti-Gr1 por vía intraperitoneal en un ángulo de 30 grados con una jeringa de insulina de un mililitro. Luego use cortapelos eléctricos seguros para animales para afeitar las partes media y superior del lado dorsal del ratón.
Después de limpiar todos los pelos, aplique una cantidad generosa de ungüento depilatorio sobre la piel afeitada. Espere de 30 segundos a un minuto, luego limpie el ungüento depilatorio completamente con una toalla de papel y PBS. Después de transferir el ratón a la estación quirúrgica, esterilice el área quirúrgica y coloque una envoltura de plástico estéril sobre el ratón.
Corte una ventana en el plástico ligeramente más grande que el tamaño del área a injertar. Mantenga la piel del donante firmemente en su lugar con los fórceps en la parte posterior y corte una porción en forma de rectángulo de 10 por 10 milímetros de piel donante para injertarla junto con los fórceps con un bisturí. Retire la piel del cuerpo para evitar cortar profundamente la fascia.
Para crear un lecho de injerto, corte un área rectangular de piel de ratón que coincida con el tamaño de la pieza de piel del donante. Luego coloque la pieza de piel del donante con el lado de la epidermis hacia arriba sobre el lecho de injerto preparado. Usando la parte posterior de los fórceps, manipule la piel deslizándose hacia adelante y hacia atrás hasta que la piel del donante quede completamente plana contra el lecho del injerto.
Agregue gotas adhesivas de tejido de pegamento quirúrgico donde la piel del donante se encuentre con la piel del ratón y del donante y mantenga la piel del ratón y del donante junto con pinzas durante uno o dos segundos para que el pegamento se adhiera a los tejidos. Selle completamente el borde del injerto y deje que el pegamento se seque completamente. A continuación, corte la gasa de vaselina lo suficientemente grande como para cubrir completamente el área del injerto.
Cubra el injerto con la gasa de vaselina y presione ligeramente la gasa contra la piel con fórceps. Corte una tira de un apósito de película transparente a lo largo para que el ancho sea lo suficientemente grande como para cubrir la herida del ratón. Presione firmemente el apósito de película transparente con el lado adhesivo hacia abajo sobre la gasa.
Haga rodar rápidamente el ratón para envolver el apósito completamente alrededor del torso, asegurándose de que se ajuste bien sin impedir la respiración y que todas las extremidades estén libres para el movimiento. Después de colocar el ratón en una jaula de recuperación, monitoréelo hasta que esté alerta y se mueva. Proporcione una fuente de calor en la parte de la jaula durante al menos 15 minutos después de la recuperación.
El análisis de los injertos de 10 a 21 días después del trasplante mostró que el injerto permaneció adherente alrededor de los bordes donde la piel del donante se encuentra con la piel del ratón y el injerto permaneció más grueso e inflamado que la piel humana sana. El análisis por citometría de flujo reveló la presencia sostenida de células inmunes humanas dentro de la mayoría de los injertos, pero los recuentos variaron entre los xenoinjertos. El injerto exitoso mantuvo las células inmunes humanas.
Sin embargo, a pesar de la adherencia continua y la supervivencia del tejido del donante, los injertos que no lograron mantener las células inmunes humanas se consideran infructuosos. El análisis de las secciones teñidas con hematoxilina y eosina del injerto después de 35 días mostró epidermis intacta y la dermis es moderadamente celular compuesta de fibroblastos ovales regordetes con citoplasma sincitial pálido y linfocitos dispersos. El análisis del injerto después de 50 días mostró resultados similares con epidermis intacta y la dermis que contiene fibroblastos ovalados y deposición de matriz extracelular ligeramente mejorada.
Los xenoinjertos de piel exitosos se basan en la preparación adecuada de muestras de piel, la supresión de las respuestas inmunes neutrofílicas del ratón mediante la administración de anti-Gr1, la adherencia a los métodos de cirugía aséptica de roedores y el vendaje seguro de ratones. El modelo de trasplante de piel de xenoinjerto humano permite a los investigadores estudiar las respuestas inmunes humanas en el órgano intacto in vivo, proporcionando una nueva vía para la investigación traslacional.
