Nous décrivons les techniques nécessaires pour le modèle de greffe de peau de xénogreffe humaine, un outil important pour la manipulation des voies immunitaires et non immunitaires dans les tissus humains in vivo. Cette technique récapitule mieux la physiologie de la peau humaine que les méthodes in vitro, permettant une manipulation expérimentale préclinique in vivo. Les greffes de peau de xénogreffe peuvent être utilisées pour les tests précliniques de composés ciblant l’inflammation de la peau humaine in vivo.
Bander les souris peut être particulièrement difficile, nous vous conseillons donc de pratiquer le processus de bandage sur des souris anesthésiées saines avant d’effectuer des chirurgies. Pour commencer, préparez-vous à dermatomater l’échantillon de peau humaine dans une hotte de culture tissulaire à pression négative stérilisée sur une planche de dissection stérilisée. Placez l’échantillon de peau avec le côté épiderme vers le haut sur la planche de dissection et essuyez l’épiderme avec un tampon de préparation à l’alcool stérile suivi de PBS.
Utilisez maintenant une broche en T disséquant de 1,5 pouce pour fixer le bord le plus proche de la peau. Ensuite, dermatome l’échantillon de peau à 400 micromètres d’épaisseur et appliquez une pression constante tout en coupant vers l’avant à un angle de 30 à 45 degrés. Placez une gaze stérile imbibée de PBS stérile au fond de la boîte de Petri et placez la peau avec l’épiderme vers le haut sur la gaze humide.
Scellez et couvrez les bords de la plaque avec un film d’étanchéité semi-transparent pour vous assurer que l’échantillon n’est pas contaminé et conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius avant la greffe. Préparez les instruments stériles et la station chirurgicale pour la greffe et utilisez des serviettes en papier autoclavées comme surfaces stériles pour le placement des instruments et des souris. Après l’induction de l’anesthésie, transférez la souris sur un coussin chauffant ou une autre source de chaleur et administrez la pommade ophtalmique en tamponnant une petite goutte de pommade sur l’œil avec un doigt ganté.
Pincez la peau et injectez des analgésiques par voie sous-cutanée à un angle parallèle au corps. Après avoir soulevé la souris par la queue, exposez l’abdomen et injectez 100 microgrammes par 100 microlitres d’anti-Gr1 par voie intrapéritonéale à un angle de 30 degrés à l’aide d’une seringue à insuline d’un millilitre. Ensuite, utilisez des tondeuses électriques sans danger pour les animaux pour raser les parties médiane et supérieure de la face dorsale de la souris.
Après avoir nettoyé tous les poils, appliquez une quantité généreuse de pommade épilatoire sur la peau rasée. Attendez 30 secondes à une minute, puis essuyez complètement la pommade épilatoire avec une serviette en papier et du PBS. Après avoir transféré la souris au poste chirurgical, stérilisez la zone chirurgicale et placez une pellicule plastique stérile sur la souris.
Découpez une fenêtre dans le plastique légèrement plus grande que la taille de la zone à greffer. Tenez fermement la peau du donneur en place avec le dos de la pince et coupez une partie rectangulaire de 10 millimètres sur 10 millimètres de peau de donneur à greffer le long de la pince avec un scalpel. Retirez la peau du corps pour éviter de couper profondément dans le fascia.
Pour créer un lit de greffe, coupez une zone rectangulaire de peau de souris correspondant à la taille de la pièce de peau du donneur. Placez ensuite le morceau de peau du donneur avec le côté épiderme vers le haut sur le lit de greffe préparé. À l’aide de l’arrière de la pince, manipulez la peau en glissant d’avant en arrière jusqu’à ce que la peau du donneur repose complètement à plat contre le lit de greffe.
Ajouter des gouttes adhésives de tissu de colle chirurgicale là où la peau du donneur rencontre la peau de la souris et maintenir la peau de la souris et du donneur ensemble avec une pince pendant une à deux secondes afin que la colle adhère aux tissus. Scellez complètement le bord du greffon et laissez la colle sécher complètement. Ensuite, coupez la gaze de vaseline suffisamment grande pour couvrir complètement la zone de greffe.
Couvrir la greffe avec la gaze de vaseline et appuyer légèrement la gaze contre la peau à l’aide d’une pince. Coupez une bande d’un pansement transparent dans le sens de la longueur afin que la largeur soit assez grande pour couvrir la blessure de la souris. Appuyez fermement sur le pansement de film transparent avec le côté adhésif vers le bas sur la gaze.
Faites rouler rapidement la souris pour enrouler complètement le pansement autour du torse, en vous assurant qu’il s’adapte bien sans entraver la respiration et que tous les membres sont libres de mouvement. Après avoir placé la souris dans une cage de récupération, surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit alerte et qu’elle se déplace. Fournir une source de chaleur sur la partie de la cage pendant au moins 15 minutes après la récupération.
L’analyse des greffons 10 à 21 jours après la greffe a montré que le greffon restait adhérent sur les bords où la peau du donneur rencontre la peau de la souris et que le greffon restait plus épais et plus enflammé que la peau humaine saine. L’analyse par cytométrie de flux a révélé la présence soutenue de cellules immunitaires humaines dans la plupart des greffons, mais le nombre variait entre les xénogreffes. La greffe réussie a maintenu les cellules immunitaires humaines.
Cependant, malgré l’adhérence continue et la survie des tissus du donneur, les greffes qui n’ont pas réussi à maintenir les cellules immunitaires humaines sont considérées comme infructueuses. L’analyse des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine du greffon après 35 jours a montré un épiderme intact et le derme est modérément cellulaire composé de fibroblastes ovales dodus avec cytoplasme syncytial pâle et lymphocytes dispersés. L’analyse de la greffe après 50 jours a montré des résultats similaires avec un épiderme intact et le derme contenant des fibroblastes ovales et un dépôt de matrice extracellulaire légèrement amélioré.
Le succès des xénogreffes de peau repose sur la préparation appropriée d’échantillons de peau, la suppression des réponses immunitaires neutrophiles de souris par administration d’anti-Gr1, l’adhésion aux méthodes de chirurgie aseptique des rongeurs et le bandage sécurisé des souris. Le modèle de greffe de peau de xénogreffe humaine permet aux chercheurs d’étudier les réponses immunitaires humaines dans l’organe intact in vivo, offrant ainsi une nouvelle voie pour la recherche translationnelle.
