Descriviamo le tecniche necessarie per il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto umano, uno strumento importante per la manipolazione di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo. Questa tecnica ricapitola meglio la fisiologia della pelle umana rispetto ai metodi in vitro, consentendo la manipolazione sperimentale preclinica in vivo. I trapianti cutanei di xenotrapianto possono essere utilizzati per test preclinici di composti mirati all'infiammazione della pelle umana in vivo.
Il bendaggio dei topi può essere particolarmente impegnativo, quindi consigliamo di praticare il processo di bendaggio su topi sani anestetizzati prima di eseguire interventi chirurgici. Per iniziare, preparare a dermatomare il campione di pelle umana in un cappuccio di coltura tissutale sterilizzato a pressione negativa su un pannello di dissezione sterilizzato. Posizionare il campione di pelle con l'epidermide rivolta verso l'alto sulla scheda di dissezione e pulire l'epidermide con un tampone sterile per la preparazione all'alcool seguito da PBS.
Ora usa un perno a T da 1,5 pollici per fissare il bordo più vicino della pelle. Quindi dermatoma il campione di pelle a 400 micrometri di spessore e applicare una pressione costante mentre si taglia in avanti con un angolo di 30-45 gradi. Posizionare una garza sterile imbevuta di PBS sterile sul fondo della piastra di Petri e posizionare la pelle con l'epidermide rivolta verso l'alto sulla garza bagnata.
Sigillare e coprire i bordi della piastra con una pellicola sigillante semitrasparente per garantire che il campione non sia contaminato e conservare il campione a quattro gradi Celsius prima dell'innesto. Preparare gli strumenti sterili e la stazione chirurgica per l'innesto e utilizzare asciugamani di carta autoclavati come superfici sterili per il posizionamento di strumenti e mouse. Dopo l'induzione dell'anestesia, trasferire il mouse su una piastra riscaldante o un'altra fonte di calore e somministrare l'unguento oftalmico tamponando una piccola goccia di unguento sull'occhio con un dito guantato.
Pizzicare la pelle e iniettare analgesici per via sottocutanea con un angolo parallelo al corpo. Dopo aver sollevato il topo per la coda, esporre l'addome e iniettare 100 microgrammi per 100 microlitri di anti-Gr1 per via intraperitoneale con un angolo di 30 gradi utilizzando una siringa da insulina da un millilitro. Quindi utilizzare tagliatrici elettriche sicure per animali per radere le porzioni centrale e superiore del lato dorsale del mouse.
Dopo aver eliminato tutti i peli, applicare una generosa quantità di unguento depilatorio sulla pelle rasata. Attendere da 30 secondi a un minuto, quindi pulire completamente l'unguento depilatorio con un tovagliolo di carta e PBS. Dopo aver trasferito il mouse alla stazione chirurgica, sterilizzare l'area chirurgica e posizionare un involucro di plastica sterile sul mouse.
Tagliare una finestra nella plastica leggermente più grande della dimensione dell'area da innestare. Tenere la pelle del donatore saldamente in posizione con la pinza posteriore e tagliare una porzione rettangolare sagomata di 10 per 10 millimetri della pelle del donatore da innestare accanto alla pinza con un bisturi. Tirare la pelle lontano dal corpo per evitare di tagliare profondamente la fascia.
Per creare un letto di innesto, tagliare un'area rettangolare di pelle di topo corrispondente alle dimensioni del pezzo di pelle del donatore. Quindi posizionare il pezzo di pelle del donatore con il lato dell'epidermide verso l'alto sul letto di innesto preparato. Utilizzando la parte posteriore della pinza, manipolare la pelle scivolando avanti e indietro fino a quando la pelle del donatore si trova completamente piatta contro il letto di innesto.
Aggiungere gocce adesive per tessuti di colla chirurgica dove la pelle del donatore incontra la pelle del topo e tenere la pelle del topo e del donatore insieme con una pinza per uno o due secondi in modo che la colla aderisca ai tessuti. Sigillare completamente il bordo dell'innesto e lasciare asciugare accuratamente la colla. Quindi, tagliare una garza di petrolato abbastanza grande da coprire completamente l'area dell'innesto.
Coprire l'innesto con la garza di petrolato e premere leggermente la garza contro la pelle usando una pinza. Tagliare una striscia di una pellicola trasparente medicata longitudinalmente in modo che la larghezza sia abbastanza grande da coprire la ferita del topo. Premere con decisione la medicazione trasparente con il lato adesivo verso il basso sulla garza.
Ruota rapidamente il mouse per avvolgere completamente la medicazione attorno al busto, assicurandoti che si adatti perfettamente senza ostacolare la respirazione e che tutti gli arti siano liberi di movimento. Dopo aver posizionato il mouse in una gabbia di recupero, monitoralo fino a quando non è vigile e si muove. Fornire una fonte di calore sulla parte della gabbia per almeno 15 minuti dopo il recupero.
L'analisi degli innesti da 10 a 21 giorni dopo il trapianto ha mostrato che l'innesto è rimasto aderente attorno ai bordi in cui la pelle del donatore incontra la pelle del topo e l'innesto è rimasto più spesso e più infiammato della pelle umana sana. L'analisi mediante citometria a flusso ha rivelato la presenza sostenuta di cellule immunitarie umane nella maggior parte degli innesti, ma la conta variava tra gli xenotrapianti. L'innesto di successo ha mantenuto le cellule immunitarie umane.
Tuttavia, nonostante la continua aderenza e sopravvivenza del tessuto donatore, gli innesti che non sono riusciti a mantenere le cellule immunitarie umane sono considerati infruttuosi. L'analisi delle sezioni colorate con ematossilina ed eosina dell'innesto dopo 35 giorni ha mostrato epidermide intatta e il derma è moderatamente cellulare composto da fibroblasti ovali paffuti con citoplasma sinciziale pallido e linfociti sparsi. L'analisi dell'innesto dopo 50 giorni ha mostrato risultati simili con epidermide intatta e il derma contenente fibroblasti ovali e deposizione di matrice extracellulare leggermente migliorata.
Gli xenotrapianti cutanei di successo si basano su un'appropriata preparazione di campioni di pelle, sulla soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione anti-Gr1, sull'aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori e sul bendaggio sicuro dei topi. Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto umano consente ai ricercatori di studiare le risposte immunitarie umane nell'organo intatto in vivo, fornendo una nuova strada per la ricerca traslazionale.
