Wir skizzieren Techniken, die für das humane Xenograft-Hauttransplantationsmodell erforderlich sind, ein wichtiges Werkzeug für die Manipulation von Immun- und Nicht-Immunwegen in menschlichem Gewebe in vivo. Diese Technik rekapituliert die menschliche Hautphysiologie besser als In-vitro-Methoden und ermöglicht eine präklinische experimentelle Manipulation in vivo. Xenograft-Hauttransplantate können für präklinische Tests von Verbindungen verwendet werden, die auf menschliche Hautentzündungen in vivo abzielen.
Das Verbinden von Mäusen kann besonders schwierig sein, daher empfehlen wir, den Verbandsprozess an gesunden anästhesierten Mäusen vor der Durchführung von Operationen zu üben. Um zu beginnen, bereiten Sie die menschliche Hautprobe in einer sterilisierten Unterdruck-Gewebekulturhaube auf einem sterilisierten Dissektionsbrett vor, um sie zu dermatomieren. Legen Sie die Hautprobe mit der Epidermisseite nach oben auf das Präzierbrett und wischen Sie die Epidermis mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad ab, gefolgt von PBS.
Verwenden Sie nun einen 1,5 Zoll großen T-Stift, um den näheren Rand der Haut zu fixieren. Dann dermatome die Hautprobe in 400 Mikrometer Dicke und übe gleichmäßigen Druck aus, während sie in einem Winkel von 30 bis 45 Grad nach vorne schneidet. Legen Sie eine sterile Gaze, die mit sterilem PBS getränkt ist, auf den Boden der Petrischale und legen Sie die Haut mit der Epidermisseite nach oben auf die nasse Gaze.
Versiegeln und bedecken Sie die Plattenkanten mit einer halbtransparenten Siegelfolie, um sicherzustellen, dass die Probe nicht kontaminiert ist, und lagern Sie die Probe vor dem Pfropfen bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die sterilen Instrumente und die chirurgische Station für die Transplantation vor und verwenden Sie autoklavierte Papiertücher als sterile Oberflächen für die Platzierung von Instrumenten und Mäusen. Nach der Narkoseeinleitung die Maus auf ein Heizkissen oder eine andere Wärmequelle übertragen und die Augensalbe verabreichen, indem Sie mit einem behandschuhten Finger einen kleinen Salbentropfen auf das Auge tupfen.
Kneifen Sie die Haut und injizieren Sie subkutan Analgetika in einem Winkel parallel zum Körper. Nachdem Sie die Maus am Schwanz angehoben haben, legen Sie den Bauch frei und injizieren Sie 100 Mikrogramm pro 100 Mikroliter Anti-Gr1 intraperitoneal in einem 30-Grad-Winkel mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze. Verwenden Sie dann tiersichere elektrische Haarschneidemaschinen, um den mittleren und oberen Teil der Rückenseite der Maus zu rasieren.
Nachdem Sie alle Haare gereinigt haben, tragen Sie eine großzügige Menge Haarentfernungssalbe auf die rasierte Haut auf. Warten Sie 30 Sekunden bis eine Minute und wischen Sie dann die Haarentfernungssalbe vollständig mit einem Papiertuch und PBS ab. Nachdem Sie die Maus in die chirurgische Station gebracht haben, sterilisieren Sie den chirurgischen Bereich und legen Sie eine sterile Plastikfolie über die Maus.
Schneiden Sie ein Fenster in den Kunststoff, das etwas größer ist als die Größe des zu pfropfenden Bereichs. Halten Sie die Spenderhaut mit der Pinzettenrückseite fest an Ort und Stelle und schneiden Sie ein rechteckiges 10 x 10 Millimeter großes Stück Spenderhaut ab, das mit einem Skalpell neben die Pinzette gepfropft werden soll. Ziehen Sie die Haut vom Körper weg, um zu vermeiden, dass Sie tief in die Faszie schneiden.
Um ein Transplantatbett zu erstellen, schneiden Sie einen rechteckigen Bereich der Maushaut ab, der der Größe des Spenderhautstücks entspricht. Legen Sie dann das Spenderhautstück mit der Epidermisseite nach oben auf das vorbereitete Transplantatbett. Manipulieren Sie mit der Rückseite der Pinzette die Haut, die hin und her gleitet, bis die Spenderhaut völlig flach gegen das Transplantatbett liegt.
Fügen Sie chirurgische Klebstoffgewebeklebetropfen hinzu, wo die Spenderhaut auf die Maushaut trifft, und halten Sie die Maus und die Spenderhaut mit einer Pinzette für ein bis zwei Sekunden zusammen, so dass der Klebstoff am Gewebe haftet. Verschließen Sie den Rand des Transplantats vollständig und lassen Sie den Kleber gründlich trocknen. Als nächstes schneiden Sie Petrolatumgaze groß genug, um den Transplantatbereich vollständig zu bedecken.
Bedecken Sie das Transplantat mit der Vaselinegaze und drücken Sie die Gaze mit einer Pinzette leicht gegen die Haut. Schneiden Sie einen Streifen eines transparenten Filmverbandes der Länge nach ab, so dass die Breite groß genug ist, um die Wunde der Maus zu bedecken. Drücken Sie den transparenten Filmverband mit der Klebeseite nach unten fest über die Gaze.
Rollen Sie schnell die Maus, um den Verband vollständig um den Oberkörper zu wickeln, um sicherzustellen, dass er fest sitzt, ohne die Atmung zu behindern und alle Gliedmaßen frei für die Bewegung sind. Nachdem Sie die Maus in einen Wiederherstellungskäfig gesetzt haben, überwachen Sie sie, bis sie wachsam ist und sich bewegt. Stellen Sie eine Wärmequelle auf der Seite des Käfigs für mindestens 15 Minuten nach der Wiederherstellung bereit.
Die Analyse von Transplantaten 10 bis 21 Tage nach der Transplantation zeigte, dass das Transplantat an den Rändern haftete, wo die Haut des Spenders auf die Haut der Maus trifft, und das Transplantat dicker und entzündeter blieb als gesunde menschliche Haut. Die Analyse durch Durchflusszytometrie zeigte das anhaltende Vorhandensein menschlicher Immunzellen in den meisten Transplantaten, aber die Anzahl variierte zwischen Xenotransplantaten. Das erfolgreiche Transplantat hielt die menschlichen Immunzellen aufrecht.
Trotz fortgesetzter Haftung und Überleben von Spendergewebe gelten Transplantate, die die menschlichen Immunzellen nicht erhalten konnten, als erfolglos. Die Analyse von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitten des Transplantats nach 35 Tagen zeigte eine intakte Epidermis und die Dermis ist mäßig zellulär und besteht aus prallen ovalen Fibroblasten mit blassem synzytialem Zytoplasma und verstreuten Lymphozyten. Die Analyse des Transplantats nach 50 Tagen zeigte ähnliche Ergebnisse mit intakter Epidermis und der Dermis mit ovalen Fibroblasten und leicht verbesserter extrazellulärer Matrixablagerung.
Erfolgreiche Hautxenotransplantate beruhen auf der geeigneten Vorbereitung von Hautproben, der Unterdrückung neutrophiler Immunantworten der Maus durch Anti-Gr1-Verabreichung, der Einhaltung aseptischer Nagetieroperationsmethoden und der sicheren Bandagierung von Mäusen. Das menschliche Xenograft-Hauttransplantationsmodell ermöglicht es Forschern, menschliche Immunantworten im intakten Organ in vivo zu untersuchen, was einen neuen Weg für die translationale Forschung eröffnet.
