Мы описываем методы, необходимые для модели трансплантации кожи ксенотрансплантата человека, важного инструмента для манипулирования иммунными и неиммунными путями в тканях человека in vivo. Этот метод лучше повторяет физиологию кожи человека, чем методы in vitro, что позволяет проводить доклинические экспериментальные манипуляции in vivo. Пересадка кожи ксенотрансплантатом может быть использована для доклинического тестирования соединений, нацеленных на воспаление кожи человека in vivo.
Перевязка мышей может быть особенно сложной задачей, поэтому мы бы посоветовали практиковать процесс перевязки на здоровых обезболенных мышах перед выполнением операций. Для начала подготовьте к дерматом образец кожи человека в стерилизованном вытяжке для культивирования тканей с отрицательным давлением на стерилизованной рассеченной доске. Поместите образец кожи с эпидермисом стороной вверх на рассеченную доску и протрите эпидермис стерильной прокладкой для приготовления спирта, а затем PBS.
Теперь используйте 1,5-дюймовый рассекающий Т-образный штифт, чтобы зафиксировать более близкий край кожи. Затем дерматом обрабатывают кожу образца толщиной 400 микрометров и применяют устойчивое давление при разрезании вперед под углом от 30 до 45 градусов. Поместите стерильную марлю, смоченную в стерильном PBS, на дно чашки Петри и поместите кожу с эпидермисом стороной вверх на влажную марлю.
Запечатайте и накройте края пластин полупрозрачной уплотнительной пленкой, чтобы убедиться, что образец не загрязнен, и храните образец при четырех градусах Цельсия перед прививкой. Подготовьте стерильные инструменты и хирургическую станцию к пересадке и используйте автоклавные бумажные полотенца в качестве стерильных поверхностей для размещения инструментов и мышей. После индукции анестезии перенесите мышь на грелку или другой источник тепла и введите офтальмологическую мазь, нанеся небольшую каплю мази на глаз пальцем в перчатке.
Защемляют кожу и подкожно вводят анальгетики под углом, параллельным телу. Подняв мышь за хвост, обнажите брюшко и введите 100 мкг на 100 микролитров анти-Gr1 внутрибрюшинно под углом 30 градусов с помощью одного миллилитра инсулинового шприца. Затем используйте безопасные для животных электрические кусачки, чтобы побрить среднюю и верхнюю части спинной стороны мыши.
После очистки всех волосков нанесите обильное количество мази для удаления волос на бритую кожу. Подождите от 30 секунд до одной минуты, затем полностью протрите мазь для удаления волос бумажным полотенцем и PBS. После переноса мыши на хирургическую станцию стерилизуйте хирургическую область и наденьте на мышь стерильную полиэтиленовую пленку.
Вырежьте из пластика окно, немного превышающее размер участка, подлежащего прививке. Крепко удерживайте донорскую кожу на месте щипцами сзади и вырежьте прямоугольную часть донорской кожи в форме 10 на 10 миллиметров, которая будет пересажена вместе с щипцами скальпелем. Оттяните кожу от тела, чтобы избежать глубокого врезания в фасцию.
Чтобы создать трансплантатную кровать, отрежьте прямоугольную область кожи мыши, соответствующую размеру куска кожи донора. Затем поместите донорский кусочек кожи эпидермисом стороной вверх на подготовленную ложе трансплантата. Используя заднюю часть щипцов, манипулируйте кожей, скользящей взад и вперед, пока донорская кожа не ляжет совершенно ровно на трансплантатную кровать.
Добавьте хирургические клеевые тканевые адгезивные капли там, где донорская кожа встречается с кожей мыши, и удерживайте кожу мыши и донора вместе с щипцами в течение одной-двух секунд, чтобы клей прилип к тканям. Полностью запечатайте край трансплантата и дайте клею тщательно высохнуть. Далее нарежьте вазелиновую марлю, достаточно большую, чтобы полностью покрыть область трансплантата.
Накройте трансплантат вазелиновой марлей и слегка прижмите марлю к коже с помощью щипцов. Вырежьте полоску прозрачной пленки, повязочной вдоль, чтобы ширина была достаточно большой, чтобы покрыть рану мыши. Плотно прижмите прозрачную пленочную повязку клеевой стороной вниз поверх марли.
Быстро сверните мышь, чтобы полностью обернуть повязку вокруг туловища, гарантируя, что она плотно прилегает, не препятствуя дыханию, и все конечности свободны для движения. Поместив мышь в клетку восстановления, следите за ней, пока она не станет бдительной и не будет двигаться. Обеспечьте источник тепла со стороны клетки в течение не менее 15 минут после рекуперации.
Анализ трансплантатов через 10-21 день после трансплантации показал, что трансплантат оставался прилипшим по краям, где кожа донора встречается с кожей мыши, а трансплантат оставался толще и более воспаленным, чем здоровая кожа человека. Анализ с помощью проточной цитометрии показал устойчивое присутствие иммунных клеток человека в большинстве трансплантатов, но количество варьировалось между ксенотрансплантатами. Успешный трансплантат поддерживал иммунные клетки человека.
Однако, несмотря на продолжающуюся приверженность и выживание донорской ткани, трансплантаты, которые не смогли сохранить иммунные клетки человека, считаются неудачными. Анализ окрашенных гематоксилином и эозином участков трансплантата через 35 дней показал интактный эпидермис и дерму умеренно клеточную, состоящую из пухлых овальных фибробластов с бледной синцитиальной цитоплазмой и рассеянными лимфоцитами. Анализ трансплантата через 50 дней показал аналогичные результаты при интактном эпидермисе и дерме, содержащих овальные фибробласты и слегка усиленное отложение внеклеточного матрикса.
Успешные ксенотрансплантаты кожи полагаются на надлежащую подготовку образцов кожи, подавление нейтрофильных иммунных реакций мышей путем введения анти-Gr1, соблюдение методов асептической хирургии грызунов и безопасную перевязку мышей. Модель трансплантации кожи ксенотрансплантата человека позволяет исследователям изучать иммунные реакции человека в интактном органе in vivo, обеспечивая новый путь для трансляционных исследований.
