En este protocolo, las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea se extraen por el método de adherencia secundaria. Las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea pueden diferenciarse con éxito en osteoclastos, lo que proporciona un modelo celular estable para el estudio de los osteoclastos in vitro. Este método es adecuado para pequeñas muestras de médula ósea y puede extraer células de monocitos-macrófagos de médula ósea de la médula ósea de manera simple y rápida sin requerir equipos de laboratorio de alta tecnología.
El aumento de osteoclastos puede ser la patogénesis potencial de la osteoporosis. Las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea tienen cierto valor de investigación como células precursoras de osteoclastos. Para comenzar, sumerja a las ratas sacrificadas en alcohol al 75% durante 10 minutos para la desinfección.
Después de extraer cuidadosamente todas las extremidades de la rata con tijeras y fórceps, aspire con PBS usando una pipeta y enjuague la sangre adherida a las extremidades. Luego, a dos mililitros del 10% FBS DMEM en un tubo de cinco mililitros. Después de transferir los huesos de las extremidades al tubo de cinco mililitros, use tijeras para cortar los huesos de las extremidades en el tubo en trozos pequeños y mezcle el homogeneizado para resuspendir las células de la médula ósea en el medio de cultivo.
Párese durante cinco minutos hasta que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo. A continuación, agregue 10 mililitros de 10% FBS DMEM en un plato de cultivo de 100 milímetros y luego transfiera el sobrenadante al plato de cultivo. Incubar a 37 grados Centígrados en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas.
Después de este tiempo de incubación, la mayoría de las células madre mesenquimales se adherirán a la pared del plato de cultivo y crecerán lentamente, mientras que la mayoría de las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea aún estarán suspendidas en el medio de cultivo. Transfiera la suspensión celular en el plato de cultivo de 100 milímetros a un nuevo matraz cuadrado de 25 centímetros y continúe cultivando las células a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono durante 24 horas adicionales. Después de retirar el medio viejo con cuidado, reemplácelo con medio fresco después de que las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea se hayan adherido a la pared del matraz.
La citometría de flujo mostró que el porcentaje de células que expresan CD11b y c, un marcador molecular en la superficie de las células del linaje de monocitos-macrófagos fue de aproximadamente el 37,94%Con la proliferación celular continua, la mayoría de las células se hicieron más grandes dentro de forma irregular y se convirtieron en un disco adherente radial. Los resultados de la tinción TRAP mostraron que, en comparación con el grupo de control, el número de gránulos rojos púrpura intracelulares aumentó significativamente en las células inducidas con el activador del receptor del ligando kappa B del factor nuclear y el factor estimulante de colonias de macrófagos. El análisis de Western blot demostró que los niveles de expresión de las proteínas específicas de osteoclasto TRAP y catepsina K aumentaron significativamente en las células tratadas en comparación con el grupo de control.
Lo más importante en este procedimiento es el tiempo para recolectar células adherentes secundarias en 24 a 48 horas de cultivo primario, las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea comienzan a adherirse por completo. Las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea aisladas por este método pueden ser inducidas en osteoclastos in vitro, proporcionando un modelo celular estable para el estudio de la osteoporosis.
