В этом протоколе моноцитарно-макрофаговые клетки костного мозга экстрагируются методом вторичной адгезии. Клетки моноцитов-макрофагов костного мозга могут успешно дифференцироваться в остеокласты, что обеспечивает стабильную клеточную модель для изучения остеокластов in vitro. Этот метод подходит для небольших образцов костного мозга и может извлекать моноцитарно-макрофагальные клетки костного мозга из костного мозга просто и быстро, не требуя высокотехнологичного лабораторного оборудования.
Увеличение остеокластов может быть потенциальным патогенезом остеопороза. Моноцитарно-макрофаговые клетки костного мозга имеют определенную исследовательскую ценность как клетки-предшественники остеокластов. Для начала погрузите усыпленных крыс в 75% спирт на 10 минут для дезинфекции.
После тщательного удаления всех конечностей крысы ножницами и щипцами, аспирировать PBS с помощью пипетки и промыть кровь, прилипшую к конечностям. Затем на двух миллилитрах 10% FBS DMEM в пятимиллилитровую трубку. После переноса костей конечностей в пятимиллилитровую трубку используйте ножницы, чтобы разрезать кости конечностей в трубке на мелкие кусочки и смешать гомогенат для повторного суспендирования клеток костного мозга в культуральную среду.
Постоять пять минут, пока фрагменты ткани не осядут на дно трубки. Затем добавьте 10 миллилитров 10% FBS DMEM в 100-миллиметровую культуральную чашку, а затем переложите супернатант в чашку для культуры. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе в течение примерно 24 часов.
После этого инкубационного времени большинство мезенхимальных стволовых клеток будут прилипать к стенке культуральной чашки и медленно расти, в то время как большинство моноцитарно-макрофаговых клеток костного мозга все еще будут взвешены в культуральной среде. Переместите клеточную суспензию в 100-миллиметровой чашке для культивирования в новую 25-сантиметровую квадратную колбу и продолжайте культивировать клетки при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе в течение дополнительных 24 часов. После осторожного удаления старой среды заменяют свежей средой после того, как моноцитарно-макрофагальные клетки костного мозга прилипнут к стенке колбы.
Проточная цитометрия показала, что процент клеток, экспрессирующих CD11b и c, молекулярный маркер на поверхности клеток моноцитарно-макрофаговой линии, составлял примерно 37,94% При непрерывной пролиферации клеток большинство клеток становились больше в пределах неправильной формы и росли в радиальный адгезивный диск. Результаты окрашивания TRAP показали, что по сравнению с контрольной группой количество внутриклеточных фиолетовых красных гранул было значительно увеличено в клетках, индуцированных активатором рецептора ядерного фактора каппа В лиганда и макрофагового колониестимулирующего фактора. Анализ вестерн-блоттинга показал, что уровни экспрессии специфических для остеокластов белков TRAP и катепсина K были значительно увеличены в обработанных клетках по сравнению с контрольной группой.
Самое главное в этой процедуре – это время сбора вторичных адгезивных клеток за 24 – 48 часов первичной культуры, клетки моноцитов-макрофагов костного мозга начинают прилипать полностью. Выделенные этим методом моноцитарно-макрофаговые клетки костного мозга могут быть индуцированы в остеокласты in vitro, обеспечивая стабильную клеточную модель для изучения остеопороза.
