בפרוטוקול זה, תאי מונוציטים-מקרופאג' של מח עצם מופקים בשיטת הדבקות משנית. תאי מונוציטים-מקרופאגים של מח עצם יכולים להתמיין בהצלחה לאוסטיאוקלסטים, המספקים מודל תא יציב לחקר אוסטאוקלסטים במבחנה. שיטה זו מתאימה לדגימות מח עצם קטנות ויכולה לחלץ תאי מונוציטים-מקרופאגים של מח עצם ממח העצם בפשטות ובמהירות ללא צורך בציוד מעבדה היי-טקי.
העלייה של אוסטאוקלסטים עשויה להיות הפתוגנזה הפוטנציאלית של אוסטאופורוזיס. לתאי מונוציטים-מקרופאגים של מח עצם יש ערך מחקרי מסוים כתאים מקדימים של אוסטאוקלסט. כדי להתחיל, לטבול את החולדות המתים ב 75% אלכוהול במשך 10 דקות לחיטוי.
לאחר הסרת בזהירות של כל הגפיים של החולדה עם מספריים ומלקחיים, לשאוף עם PBS באמצעות פיפטה ולשטוף את הדם הידבקות לגפיים. ואז בשני מיליליטרים של 10% FBS DMEM לתוך צינור חמישה מיליליטר. לאחר העברת עצמות הגפיים לתוך צינור חמשת מיליליטר, השתמש במספריים כדי לחתוך את עצמות הגפיים בצינור לחתיכות קטנות ולערבב את ההומוגנאט כדי להחיות את תאי מח העצם לתוך מדיום התרבית.
יש לעמוד במשך חמש דקות עד ששברי הרקמה התיישבו לתחתית הצינור. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטרים של 10% FBS DMEM לתבשיל תרבית של 100 מילימטרים, ולאחר מכן העבירו את הסופרנטנט למנת התרבית. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך כ-24 שעות.
לאחר זמן הדגירה הזה, רוב תאי הגזע המזנכימליים יידבקו לדופן התרבית ויגדלו לאט, בעוד שרוב תאי המונוציטים-מקרופאג' של מח העצם עדיין יהיו תלויים בתווך התרבית. מעבירים את תרחיף התא בצלחת תרבית של 100 מילימטרים לבקבוקון מרובע חדש של 25 ס"מ וממשיכים לטפח את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות נוספות. לאחר הסרת המדיום הישן בזהירות, החלף במדיום טרי לאחר שתאי מונוציטים-מקרופאגים של מח עצם דבקו בדופן הבקבוקון.
ציטומטריית זרימה הראתה שאחוז התאים המבטאים CD11b ו-c, סמן מולקולרי על פני השטח של תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים, היה כ-37.94% עם התפשטות התאים הרציפה, רוב התאים נעשו גדולים יותר בתוך צורה לא סדירה וגדלו לדיסק דבק רדיאלי. תוצאות כתמי TRAP הראו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, מספר הגרגירים האדומים הסגולים הסגולים התוך-תאיים גדל באופן משמעותי בתאים המושרים באמצעות מפעיל קולטן של גורם גרעיני קאפה B ליגנד וגורם מגרה מושבת מקרופאגים. ניתוח כתמים מערבי הראה כי רמות הביטוי של החלבונים הספציפיים לאוסטיאוקלסט TRAP וקתפסין K עלו באופן משמעותי בתאים שטופלו בהשוואה לקבוצת הביקורת.
הדבר החשוב ביותר בהליך זה הוא הזמן לאסוף תאים חסידיים משניים ב 24 עד 48 שעות של תרבית ראשונית, תאי מח עצם מונוציטים-מקרופאגים מתחילים להידבק לחלוטין. תאי מונוציטים-מקרופאג'ים של מח עצם המבודדים בשיטה זו יכולים להיות מושרים לתוך אוסטאוקלסטים במבחנה, ומספקים מודל תאי יציב לחקר האוסטאופורוזיס.
