このプロトコールでは、骨髄単球 - マクロファージ細胞は、二次接着法によって抽出される。骨髄単球 - マクロファージ細胞は破骨細胞に分化することに成功し、これはインビトロでの破骨細胞の研究のための安定した細胞モデルを提供する。この方法は、小さな骨髄サンプルに適しており、ハイテクラボ機器を必要とせずに、骨髄から骨髄単球 - マクロファージ細胞を簡単かつ迅速に抽出することができます。
破骨細胞の増加は、骨粗鬆症の潜在的な病因であり得る。骨髄単球-マクロファージ細胞は破骨細胞前駆細胞として一定の研究価値を有する。まず、安楽死させたラットを75%アルコールに10分間浸漬して消毒します。
ラットのすべての四肢をハサミと鉗子で慎重に取り除いた後、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。次に、10%FBS DMEMの2ミリリットルで5ミリリットルのチューブに入れます。四肢の骨を5ミリリットルのチューブに移した後、はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。
組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。次に、100ミリの培養皿に10ミリリットルの10%FBS DMEMを加え、上清を培養皿に移す。5%の二酸化炭素中で摂氏37度で約24時間インキュベートする。
このインキュベーション時間の後、間葉系幹細胞の大部分は培養皿壁に接着し、ゆっくりと増殖するが、ほとんどの骨髄単球 - マクロファージ細胞は依然として培養培地に懸濁される。100ミリメートル培養皿の細胞懸濁液を新しい25センチメートル四方のフラスコに移し、5%二酸化炭素中で摂氏37度で細胞をさらに24時間培養し続ける。古い培地を慎重に取り除いた後、骨髄単球・マクロファージ細胞がフラスコ壁に付着した後、新鮮な培地と交換する。
フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11bおよびcを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した連続的な細胞増殖により、細胞の大部分は不規則な形状内で大きくなり、放射状の付着性ディスクに成長した。TRAP染色の結果から、対照群と比較して、核因子カッパBリガンドおよびマクロファージコロニー刺激因子の受容体活性化剤で誘導された細胞において細胞内紫赤色顆粒の数が有意に増加したことが示された。ウェスタンブロット解析は、破骨細胞特異的タンパク質TRAPおよびカテプシンKの発現レベルが、対照群と比較して処理細胞において有意に増加したことを実証した。
この手順で最も重要なことは、初代培養の24〜48時間で二次接着細胞を採取する時間であり、骨髄単球 - マクロファージ細胞は完全に接着し始める。この方法により単離された骨髄単球・マクロファージ細胞は、インビトロで破骨細胞に誘導することができ、骨粗鬆症の研究のための安定な細胞モデルを提供する。
