이 프로토콜에서, 골수 단핵구-대식세포는 이차 부착 방법에 의해 추출된다. 골수 단핵구-대식세포는 파골세포로 성공적으로 분화할 수 있으며, 이는 시험관 내에서 파골세포의 연구를 위한 안정한 세포 모델을 제공한다. 이 방법은 작은 골수 샘플에 적합하며 첨단 실험실 장비를 필요로하지 않고 골수에서 골수 단핵구 - 대식세포 세포를 간단하고 신속하게 추출 할 수 있습니다.
파골세포의 증가는 골다공증의 잠재적 발병기전일 수 있다. 골수 단핵구-대식세포는 파골세포 전구체 세포로서 특정 연구 가치를 갖는다. 시작하려면 안락사 된 쥐를 소독을 위해 75 % 알코올에 10 분 동안 담그십시오.
가위와 집게로 쥐의 모든 팔다리를 조심스럽게 제거한 후, 피펫을 사용하여 PBS로 흡인하고 팔다리에 부착 된 혈액을 플러시하십시오. 그런 다음 10 % FBS DMEM의 두 밀리리터에서 다섯 밀리리터 튜브에 넣습니다. 사지 뼈를 다섯 밀리리터 튜브로 옮긴 후 가위를 사용하여 튜브의 사지 뼈를 작은 조각으로 자르고 균질액을 혼합하여 골수 세포를 배양 배지에 재현탁시킵니다.
조직 파편이 튜브의 바닥에 정착 할 때까지 다섯 분 동안 방치하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 10 % FBS DMEM을 100 밀리미터 배양 접시에 넣은 다음 상청액을 배양 접시로 옮깁니다. 약 24시간 동안 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 배양한다.
이 배양 시간 후에, 대부분의 중간엽 줄기 세포는 배양 접시 벽에 부착되어 천천히 성장할 것이며, 반면에 대부분의 골수 단핵구-대식세포는 여전히 배양 배지에 현탁될 것이다. 세포 현탁액을 100 밀리미터 배양 접시에 새로운 25 센티미터 평방 플라스크로 옮기고 추가로 24 시간 동안 5 % 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양한다. 오래된 배지를 조심스럽게 제거한 후, 골수 단핵구-대식세포가 플라스크 벽에 부착된 후 신선한 배지로 교체한다.
유세포 분석기는 단핵구-대식세포 계통 세포의 표면에 분자 마커인 CD11b 및 c를 발현하는 세포의 비율이 약 37.94%로 나타났다. TRAP 염색 결과는 대조군과 비교하여, 핵인자인 카파 B 리간드 및 대식세포 콜로니 자극인자의 수용체 활성화제로 유도된 세포에서 세포내 보라색 적색 과립의 수가 유의하게 증가하였다는 것을 보여주었다. 웨스턴 블롯 분석은 파골세포 특이적 단백질 TRAP 및 카텝신 K의 발현 수준이 대조군에 비해 처리된 세포에서 유의하게 증가하였다는 것을 입증하였다.
이 절차에서 가장 중요한 것은 일차 배양 후 24 내지 48 시간에 이차 부착성 세포를 수집하는 시간이며, 골수 단핵구-대식세포 세포가 완전히 부착되기 시작한다. 골수 단핵구-대식세포는 시험관내에서 파골세포로 유도될 수 있으며, 골다공증 연구를 위한 안정한 세포 모델을 제공한다.
