In diesem Protokoll werden Monozyten-Makrophagen-Zellen des Knochenmarks durch sekundäre Adhärenzmethode extrahiert. Knochenmarkmonozyten-Makrophagenzellen können sich erfolgreich zu Osteoklasten differenzieren, was ein stabiles Zellmodell für die Untersuchung von Osteoklasten in vitro liefert. Diese Methode eignet sich für kleine Knochenmarkproben und kann Knochenmark-Monozyten-Makrophagenzellen einfach und schnell aus dem Knochenmark extrahieren, ohne dass High-Tech-Laborgeräte benötigt werden.
Die Zunahme von Osteoklasten kann die potenzielle Pathogenese der Osteoporose sein. Knochenmarkmonozyten-Makrophagenzellen haben einen gewissen Forschungswert als Osteoklasten-Vorläuferzellen. Um zu beginnen, tauchen Sie die eingeschläferten Ratten in 75% Alkohol für 10 Minuten zur Desinfektion.
Nachdem Sie vorsichtig alle Gliedmaßen der Ratte mit einer Schere und einer Pinzette entfernt haben, aspirieren Sie mit PBS mit einer Pipette und spülen Sie das Blut, das an den Gliedmaßen haftet. Dann bei zwei Millilitern des 10%FBS DMEM in eine fünf Milliliter Röhre. Nachdem Sie die Gliedmaßenknochen in das Fünf-Milliliter-Rohr übertragen haben, schneiden Sie mit einer Schere die Gliedmaßenknochen im Röhrchen in kleine Stücke und mischen Sie das Homogenat, um die Knochenmarkzellen in das Kulturmedium zu resuspendieren.
Stehen Sie fünf Minuten lang, bis sich die Gewebefragmente am Boden der Röhre abgesetzt haben. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter 10% FBS DMEM in eine 100-Millimeter-Kulturschale hinzu und übertragen dann den Überstand in die Kulturschale. Bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für ca. 24 Stunden inkubieren.
Nach dieser Inkubationszeit haftet die Mehrheit der mesenchymalen Stammzellen an der Kulturschalenwand und wächst langsam, während die meisten Monozyten-Makrophagen-Zellen des Knochenmarks noch im Kulturmedium suspendiert sind. Übertragen Sie die Zellsuspension in der 100-Millimeter-Kulturschale in einen neuen 25-Zentimeter-Quadratkolben und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für weitere 24 Stunden. Nachdem Sie das alte Medium vorsichtig entfernt haben, ersetzen Sie es durch frisches Medium, nachdem die Monozyten-Makrophagenzellen des Knochenmarks an der Kolbenwand haftet haben.
Die Durchflusszytometrie zeigte, dass der Prozentsatz der Zellen, die CD11b und c, einen molekularen Marker auf der Oberfläche von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, exprimieren, etwa 37,94% betrug. Mit der kontinuierlichen Zellproliferation wurde die Mehrheit der Zellen in unregelmäßiger Form größer und wuchs zu einer radialen adhärenten Bandscheibe heran. Die TRAP-Färbungsergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Anzahl der intrazellulären violettroten Granula in den Zellen, die mit dem Rezeptoraktivator des Kernfaktors kappa B-Ligand und dem Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor induziert wurden, signifikant erhöht war. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expressionsniveaus der osteoklastenspezifischen Proteine TRAP und Cathepsin K in den behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht waren.
Das Wichtigste bei diesem Verfahren ist die Zeit, um sekundäre adhärente Zellen in 24 bis 48 Stunden Primärkultur zu sammeln, Knochenmarkmonozyten-Makrophagenzellen beginnen vollständig zu haften. Mit dieser Methode isolierte Monozyten-Makrophagen-Zellen des Knochenmarks können in vitro zu Osteoklasten induziert werden, was ein stabiles Zellmodell für die Untersuchung von Osteoporose darstellt.
