In questo protocollo, le cellule monociti-macrofagi del midollo osseo vengono estratte con il metodo di aderenza secondaria. Le cellule monocita-macrofagi del midollo osseo possono differenziarsi con successo in osteoclasti, il che fornisce un modello cellulare stabile per lo studio degli osteoclasti in vitro. Questo metodo è adatto per piccoli campioni di midollo osseo e può estrarre le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo dal midollo osseo in modo semplice e rapido senza richiedere attrezzature di laboratorio ad alta tecnologia.
L'aumento degli osteoclasti può essere la potenziale patogenesi dell'osteoporosi. Le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo hanno un certo valore di ricerca come cellule precursori degli osteoclasti. Per iniziare, immergere i ratti eutanasizzati in alcool al 75% per 10 minuti per la disinfezione.
Dopo aver accuratamente rimosso tutti gli arti del ratto con forbici e pinze, aspirare con PBS usando una pipetta e lavare il sangue aderente agli arti. Quindi a due millilitri del DMEM 10% FBS in un tubo da cinque millilitri. Dopo aver trasferito le ossa degli arti nel tubo da cinque millilitri, utilizzare le forbici per tagliare le ossa degli arti nel tubo in piccoli pezzi e mescolare l'omogeneizzato per risospescere le cellule del midollo osseo nel terreno di coltura.
Riposare per cinque minuti fino a quando i frammenti di tessuto si sono depositati sul fondo del tubo. Quindi, aggiungere 10 millilitri di DMEM 10% FBS in un piatto di coltura da 100 millimetri, quindi trasferire il surnatante nel piatto di coltura. Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per circa 24 ore.
Dopo questo tempo di incubazione, la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali aderirà alla parete del piatto di coltura e crescerà lentamente, mentre la maggior parte delle cellule monociti-macrofagi del midollo osseo sarà ancora sospesa nel terreno di coltura. Trasferire la sospensione cellulare nel piatto di coltura da 100 millimetri in un nuovo pallone quadrato di 25 centimetri e continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius nel 5% di anidride carbonica per altre 24 ore. Dopo aver rimosso il vecchio mezzo con attenzione, sostituire con mezzo fresco dopo che le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo hanno aderito alla parete del pallone.
La citometria a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule che esprimono CD11b e c, un marcatore molecolare sulla superficie delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi era di circa il 37,94%Con la proliferazione cellulare continua, la maggior parte delle cellule è diventata più grande all'interno di una forma irregolare ed è cresciuta in un disco aderente radiale. I risultati della colorazione TRAP hanno mostrato che rispetto al gruppo di controllo, il numero di granuli rosso porpora intracellulare era significativamente aumentato nelle cellule indotte con attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare kappa B e del fattore stimolante della colonia macrofagica. L'analisi Western blot ha dimostrato che i livelli di espressione delle proteine specifiche dell'osteoclasto TRAP e della catepsina K erano significativamente aumentati nelle cellule trattate rispetto al gruppo di controllo.
La cosa più importante in questa procedura è il tempo di raccogliere le cellule aderenti secondarie in 24-48 ore di coltura primaria, le cellule monociti-macrofagi del midollo osseo iniziano ad aderire completamente. Le cellule monocita-macrofagi del midollo osseo isolate con questo metodo possono essere indotte in osteoclasti in vitro, fornendo un modello cellulare stabile per lo studio dell'osteoporosi.
