Las caspasas son proteasas de cisteína que escinden sustratos durante la apoptosis y los procesos no apoptóticos. Este protocolo describe un ensayo de escisión in vitro para identificar sustratos putativos de la caspasa iniciadora Dronc de Drosophila. Si se sigue cuidadosamente, este protocolo proporciona un procedimiento confiable para el cribado de alto rendimiento de sustratos putativos de la caspasa Dronc, o cualquier otra caspasa.
Si bien este protocolo ha sido diseñado para ensayos de escisión in vitro utilizando la Drosophila caspasa Dronc, se puede adaptar fácilmente para caspasas de otros organismos, incluidos los mamíferos. Es importante que la purificación de las caspasas recombinantes y los ensayos de escisión in vitro se realicen el mismo día porque estas preparaciones de caspasas pierden actividad enzimática rápidamente. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Prathibha Yarikipati, becario postdoctoral de mi laboratorio.
Para comenzar, retire los tubos congelados con los cultivos peletizados de almacenamiento a menos 80 grados centígrados y manténgalos en hielo durante 10 minutos para ablandar el pellet. Después de 10 minutos, agregue 0,6 mililitros de tampón de lisis celular bacteriana suplementado con inhibidores de la proteasa recién agregados, 10 miligramos por mililitro de lisozima y 50 unidades por mililitro de benzonasa, en los tubos que contienen pellets utilizando un controlador de pipeta con una pipeta serológica de un mililitro. Con la misma punta de pipeta, disolver el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que una solución transparente de color amarillo pálido, sin partículas de pellets, sea visible e incubar durante 30 minutos en hielo.
Transfiera los lisados a los tubos de centrífuga apropiados y centrífugolos a 17, 000 G durante 40 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera los sobrenadantes a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, que es el extracto crudo que contiene las caspasas, y mantenga los tubos en hielo. Agregue 0.2 mililitros de la suspensión al 50% de ácido Ni-nitriloacético agarosa a cada tubo de los extractos de caspasa, y gire los tubos en un rotador de extremo a extremo durante una hora a 4 grados centígrados.
Después de una hora, agregue el extracto con la agarosa de ácido Ni-nitriloacético a columnas de polipropileno de un mililitro con una punta intacta, colocada en una rejilla, y déjelo reposar durante cinco minutos para permitir que la agarosa de ácido Ni-nitriloacético se asiente. Después de cinco minutos, retire la tapa de las columnas y deje que el sobrenadante fluya por gravedad. Luego, agregue cuidadosamente un mililitro del tampón de lavado a las columnas sin alterar la resina empaquetada de agarosa de ácido Ni-nitriloacético, y lávela a través del flujo por gravedad.
Para la elución de las caspasas, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros debajo de la boquilla colectora de las columnas, después del drenaje completo del tampón de lavado. Luego, agregue 0.5 mililitros del tampón de elución a cada columna y recoja el eluyente en los tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitros. Mantenga los eluyentes en hielo y mida la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford.
Dependiendo del nivel de expresión del sustrato putativo, use de 1 a 10 microlitros del lisado de reticulocitos de conejo programado con la proteína de interés en el ensayo de escisión y manténgalo en hielo. Agregue 10 microgramos de proteína caspasa purificada generada previamente y lleve el volumen total de reacción a 50 microlitros con tampón de ensayo de caspasa. Incubar las reacciones en un baño de agua a 30 grados centígrados durante tres horas, asegurándose de incluir los controles apropiados en el ensayo de escisión.
Después de tres horas, detenga las reacciones transfiriendo los tubos en hielo y agregue un volumen de tampón de muestra LDS que contenga 50 milimolares de TDT. Incubar las muestras a 75 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos. Gire rápidamente, mezcle con el movimiento, cargue 24 microlitros por muestra y ejecute la página SDS o almacene las muestras a menos 20 grados centígrados.
Cuatro caspasas recombinantes diferentes fueron inducidas, purificadas y analizadas por SDS-PAGE, inmunobloted, y el blot fue sondeado con un anticuerpo antihistidina. El Dronc 6x-Histidine sin procesar funciona a un peso molecular relativo de 55 kilodalton y el DRICE 6x-His sin procesar tiene un peso molecular de 35 kilodalton. El procesamiento automático de las caspasas es visible por la aparición de bandas de menor peso molecular.
Para Dronc escindido, es una banda de 40 kilodalton. Para Drice escindido, es una banda de 23 kilodalton. Después de la reacción de escisión in vitro, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, inmunobloted, y los blots se incubaron con un anticuerpo anti-Myc para detectar Drice C211A marcado con Myc de forma terminal.
Los resultados demostraron que la preparación de tipo salvaje 6x-histidina Dronc producida y purificada bacterianamente tiene actividad enzimática. Esto es visible por la presencia de la banda más pequeña de Drice escindido en comparación con el proDrice tío. La reacción de escisión in vitro que utiliza caspasa recombinante y sustrato se analizó mediante SDS-PAGE e immunoblot.
Para el análisis de la reacción de escisión, se utilizó el anticuerpo Drice anti escisión en este inmunoblot. Los resultados demostraron que la preparación 6x-His Dronc producida y purificada bacterialmente tiene actividad enzimática. Esto es visible por la presencia de la banda más pequeña de Drice escindido en comparación con el proDrice tío.
Recuerde que las caspasas recombinantes pierden actividad enzimática rápidamente. No se pueden almacenar, ni siquiera a menos 80 grados centígrados. Los ensayos de escisión in vitro deben realizarse el mismo día.
Los impactos positivos en el ensayo de escisión in vitro deben validarse in vivo. Esto se puede hacer en células o en organismos genéticos modelo como Drosophila o C.elegans.
