Este protocolo permite el análisis del endocardio primitivo en orientación plana. Podemos analizar la distribución de las células endocárdicas, la anisotropía de otras medidas cautelares y describir la forma de una sola célula endocárdica durante el desarrollo de la válvula. En comparación con las secciones de tejido clásicas, la imagen en cara de la región regenerativa de la válvula interna permite el análisis de la polaridad celular plana y la dinámica de las células endocárdicas durante el desarrollo de la válvula en embriones intactos.
Este método se puede utilizar para profundizar el conocimiento de la polaridad celular plana durante el desarrollo cardiovascular. Comience colocando el útero extirpado de ratones preñados sacrificados en una placa de Petri que contenga PBT helado. Retire el deciduye individual del útero bajo un microscopio de disección usando fórceps finos.
Usando pinzas finas, haga una incisión en la parte blanca de la decidua, que es donde está el embrión. Retírelo suavemente, evite tirar y transfiera los embriones a una nueva placa de Petri con PBT fresco usando un P-1000 con la punta cortada, dejando un diámetro lo suficientemente grande como para que un embrión pase sin romperse. Para el genotipado, tome un pequeño trozo del saco vitelino de aproximadamente 0,5 milímetros cuadrados o un trozo de la cola del extremo posterior, contando de cinco a 10 somitas hacia la cabeza y digerirlo en 100 mililitros del tampón apropiado.
Bajo la campana extractora, transfiera los embriones al 4% de PFA helado en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros a cuatro grados centígrados. Fije los embriones de dos horas a toda la noche a cuatro grados centígrados en un nutador. Debajo de la campana extractora, retire el fijador de PFA al 4% de los tubos de microcentrífuga sin tocar los embriones.
Deseche el PFA en un recipiente apropiado. Lave los embriones cinco veces en PBT frío durante 10 minutos a temperatura ambiente. Con pinzas finas, retire el corazón y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con PBT fresco.
Reemplace PBT con PBS Triton y lave las muestras tres veces, cinco minutos cada una, a temperatura ambiente en un agitador orbital. Reemplace PBS Triton con una solución bloqueante que contenga PBS Triton con suero bovino inactivado por calor al 10%. Incubar desde dos horas hasta toda la noche a cuatro grados centígrados en un agitador orbital.
Reemplace la solución de bloqueo con una solución de bloqueo que contenga anticuerpos primarios a la concentración deseada. Incubar durante la noche en un agitador orbital a cuatro grados centígrados. Después de la incubación nocturna a cuatro grados centígrados, incubar las muestras durante 1,5 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital.
Este paso es crucial para aumentar la relación señal-ruido. Retire y mantenga la solución de anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados, hasta tres experimentos futuros. Agregue azida de sodio a una concentración final de 0.02% para una mejor conservación.
Luego, lave los embriones tres veces con PBS Triton durante tres minutos cada uno. Lave los embriones con PBS Triton tres veces durante 30 minutos y manténgalos en un agitador orbital a cuatro grados centígrados. Después del último lavado, agregue un mililitro de solución bloqueante que contenga anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia contra la especie huésped de anticuerpos primarios.
Luego agregue DAPI a la solución e incube los embriones durante la noche en un agitador orbital a cuatro grados centígrados. Después de la incubación nocturna a cuatro grados centígrados, incubar los embriones durante 1,5 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital. Este paso es esencial para aumentar la relación señal-ruido.
Repita los pasos de lavado de PBS Triton como se menciona en el texto manuscrito. Coloque los corazones en una placa de Petri de 35 milímetros que contenga PBS. Usando un alambre de tungsteno y pinzas finas, aísle el canal auriculoventricular o el tracto de salida y córtelos longitudinalmente.
Prepare cubreobjetos, portaobjetos, pinzas, una pipeta P-200 con las puntas apropiadas, una toalla de papel y cualquier medio de montaje acuoso a base de glicerol para fluorescencia sin DAPI. Pegue dos tiras de cinta adhesiva en una diapositiva separadas de 0,3 a 0,6 centímetros para crear un espacio de habitación 3D que permita que las muestras conserven su forma original sin aplastarlas. Luego, usando aproximadamente 20 microlitros de tampón, deje caer cuidadosamente las muestras sobre el portaobjetos entre las tiras de cinta usando una punta de pipeta P-200 cortada.
Use un microscopio de disección para aumentar la precisión. Usando fórceps finos, coloque las muestras con el endocardio hacia arriba y el miocardio hacia abajo en el portaobjetos. Retire el exceso de PBS con una toalla de papel y evite tocar la muestra.
Luego, seque las muestras durante uno o dos minutos a temperatura ambiente para que las muestras se peguen al portaobjetos. Agregue 40 microlitros de medios de montaje acuosos al tejido. Coloque el deslizamiento de la cubierta sobre los dos trozos de cinta y bájelo lentamente sobre el tejido con una aguja o fórceps.
Evite crear burbujas de aire. Selle el cubreobjetos con una gota de esmalte de uñas en cada vértice del cubreobjetos. Una vez que el esmalte de uñas esté seco, limpie el exceso de medios de montaje de los lados del deslizamiento de la cubierta usando una toalla de papel absorbente.
Evite mover la cubierta. Agregue esmalte de uñas a lo largo de los bordes deslizantes de la cubierta para sellarlo completamente, evitando la evaporación del medio de montaje. Con un microscopio vertical o confocal invertido, tome imágenes con un aumento de 10X para una vista general y a 63X con un zoom de 3X para imágenes detalladas.
La forma celular del endocardio se analizó durante la formación de las válvulas a una resolución celular. Las células individuales o clones de unas pocas células expresaron GFP en el endocardio. La expresión de GFP y la combinación con la localización subcelular de VE-cadherina fue un enfoque efectivo para estudiar la relación entre la dinámica de AJ y la formación de filopodios y las células pre-EMT, ya que estas células desarrollaron protuberancias de membrana a medida que las AJ se disuelven.
Las diferencias en la intensidad de la tinción VE-cadherina en el endocardio indicaron la presencia de contractilidad anisotrópica en el endocardio embrionario del canal auriculoventricular en etapas prevalvulares. Todo el corazón se tiñó con anticuerpos VE-cadherina en E8.5 y E9.5. En E8.5, el endocardio del canal auriculoventricular tendía a tener una organización epitelial estable, y no se detectaron vértices formados por más de cuatro células.
En E9.5, se observaron vértices de hasta seis células formando estructuras en forma de roseta, similares a la organización celular descrita previamente en el epitelio sometido a reordenamientos celulares activos, lo que sugiere que el endocardio del canal auriculoventricular estaba experimentando un reordenamiento celular dinámico durante el desarrollo de la válvula. Una curva de aprendizaje es necesaria para convertirse en un experto en esta técnica. Además, se recomienda encarecidamente utilizar pinzas Sovereign y alambre de tungsteno.
Hoy en día, la visualización del endocardio prevalvular se limitó a las secciones transversales. Nuestro enfoque ofrece la posibilidad de estudiar el comportamiento embrionario del endocardio valvular desde un punto de vista plano.
