Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von primitivem Endokard in planarer Orientierung. Wir können die Verteilung von Endokardzellen, die Anisotropie anderer Verfügungen analysieren und die Form einer einzelnen Endokardzelle während der Klappenentwicklung beschreiben. Im Vergleich zu den klassischen Gewebeschnitten ermöglicht die flächendeckende Bildgebung der inneren klappenregenerativen Region die Analyse der planaren Zellpolarität und Dynamik endokardialer Zellen während der Klappenentwicklung in intakten Embryonen.
Diese Methode kann verwendet werden, um das Wissen über die planare Zellpolarität während der Kardioentwicklung zu vertiefen. Beginnen Sie, indem Sie die Gebärmutter, die von euthanasierten trächtigen Mäusen entfernt wurde, in eine Petrischale legen, die eiskaltes PBT enthält. Entfernen Sie das einzelne Deziduye aus der Gebärmutter unter einem Seziermikroskop mit einer feinen Pinzette.
Machen Sie mit einer feinen Pinzette einen Schnitt im weißen Teil der Decidua, wo sich der Embryo befindet. Entfernen Sie es vorsichtig, vermeiden Sie das Ziehen und übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem PBT mit einem P-1000 mit abgeschnittener Spitze, so dass ein Durchmesser groß genug ist, damit ein Embryo durchgehen kann, ohne zu brechen. Für die Genotypisierung nehmen Sie ein kleines Stück des Dottersacks von etwa 0,5 Quadratmillimetern oder ein Stück des Schwanzes vom hinteren Ende, zählen Sie fünf bis 10 Somiten in Richtung Kopf und verdauen Sie es in 100 Milliliter des entsprechenden Puffers.
Unter dem Abzug werden die Embryonen in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius auf eiskalte 4% PFA überführt. Fixieren Sie die Embryonen von zwei Stunden bis Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutator. Entfernen Sie unter dem Abzug das 4% PFA-Fixiermittel aus den Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Embryonen zu berühren.
Entsorgen Sie die PFA in einem geeigneten Behälter. Waschen Sie die Embryonen fünfmal in kaltem PBT für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und geben Sie es in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit frischem PBT.
Ersetzen Sie PBT durch PBS Triton und waschen Sie die Proben dreimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. PBS Triton wird durch eine Blockierungslösung ersetzt, die PBS Triton mit 10%hitzeinaktiviertem Rinderserum enthält. Inkubieren Sie von zwei Stunden bis über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler.
Ersetzen Sie die Blockierlösung durch eine Blocklösung, die einen primären Antikörper in der gewünschten Konzentration enthält. Über Nacht auf einem Orbitalshaker bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius inkubieren Sie die Proben 1,5 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler.
Dieser Schritt ist entscheidend, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Entfernen und halten Sie die primäre Antikörperlösung bei vier Grad Celsius, bis zu drei zukünftige Experimente. Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% für beste Konservierung hinzufügen.
Dann waschen Sie die Embryonen dreimal mit PBS Triton für jeweils drei Minuten. Waschen Sie die Embryonen dreimal 30 Minuten lang mit PBS Triton und halten Sie sie auf einem Orbitalschüttler bei vier Grad Celsius. Nach dem letzten Waschgang wird ein Milliliter Blockierungslösung mit fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörpern gegen die primäre Antikörperwirtsspezies hinzugefügt.
Dann fügen Sie DAPI zur Lösung hinzu und inkubieren die Embryonen über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei vier Grad Celsius. Nach der nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius inkubieren Sie die Embryonen für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker. Dieser Schritt ist unerlässlich, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
Wiederholen Sie die PBS Triton Waschschritte, wie im Textmanuskript erwähnt. Legen Sie die Herzen auf eine 35-Millimeter-Petrischale mit PBS. Isolieren Sie mit einem Wolframdraht und einer feinen Pinzette den atrioventrikulären Kanal oder den Ausflusstrakt und schneiden Sie sie längs.
Bereiten Sie Deckblätter, Objektträger, Pinzetten, eine P-200-Pipette mit den entsprechenden Spitzen, ein Papiertuch und alle wässrigen Montagemedien auf Glycerinbasis für die Fluoreszenz ohne DAPI vor. Kleben Sie zwei Streifen Klebeband auf einen Objektträger, der 0,3 bis 0,6 Zentimeter voneinander entfernt ist, um einen 3D-Raum zu schaffen, der es den Proben ermöglicht, ihre ursprüngliche Form zu bewahren, ohne sie zu zerquetschen. Anschließend lassen Sie die Proben mit etwa 20 Mikrolitern Puffer vorsichtig mit einer geschnittenen P-200-Pipettenspitze auf den Objektträger zwischen den Bandstreifen fallen.
Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um die Genauigkeit zu erhöhen. Legen Sie die Proben mit einer feinen Pinzette mit dem Endokard nach oben und dem Myokard nach unten auf den Objektträger. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Papiertuch und vermeiden Sie es, die Probe zu berühren.
Dann trocknen Sie die Proben für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur, damit die Proben am Objektträger haften. Fügen Sie dem Gewebe 40 Mikroliter wässrige Montagemedien hinzu. Legen Sie den Bezug über die beiden Klebebandstücke und senken Sie ihn langsam mit einer Nadel oder einer Pinzette auf das Gewebe.
Vermeiden Sie es, Luftblasen zu erzeugen. Versiegeln Sie den Abdeckschein mit einem Tropfen Nagellack auf jedem Scheitelpunkt des Abdeckschlickers. Sobald der Nagellack trocken ist, reinigen Sie die überschüssigen Montagemedien von den Seiten des Abdecktuchs mit einem saugfähigen Papiertuch.
Vermeiden Sie es, den Deckschein zu bewegen. Fügen Sie Nagellack entlang der Abdeckungskanten hinzu, um sie vollständig abzudichten und die Verdunstung der Montagemedien zu verhindern. Nehmen Sie mit einem aufrechten oder inversen konfokalen Mikroskop Bilder mit 10-facher Vergrößerung für die Gesamtansicht und mit 63-fachem Zoom für detaillierte Bilder auf.
Die Zellform des Endokards wurde während der Bildung der Klappen mit zellulärer Auflösung analysiert. Einzelne Zellen oder Klone einiger weniger Zellen exprimierten GFP im Endokard. Die GFP-Expression und Kombination mit der subzellulären VE-Cadherin-Lokalisation war ein effektiver Ansatz, um die Beziehung zwischen AJ-Dynamik und Filopodienbildung und prä-EMT-Zellen zu untersuchen, da diese Zellen Membranvorsprünge entwickelten, wenn sich AJs auflösen.
Unterschiede in der Intensität der VE-Cadherin-Färbung im Endokard zeigten das Vorhandensein einer anisotropen Kontraktilität im embryonalen Endokard des atrioventrikulären Kanals in prävalvulären Stadien. Das ganze Herz wurde mit VE-Cadherin-Antikörpern bei E8.5 und E9.5 angefärbt. Bei E8,5 neigte das Endokard des atrioventrikulären Kanals dazu, eine stabile Epithelorganisation zu haben, und von mehr als vier Zellen gebildete Eckpunkte wurden nicht nachgewiesen.
Bei E9.5 wurden Eckpunkte von bis zu sechs Zellen beobachtet, die rosettenartige Strukturen bildeten, ähnlich der zuvor beschriebenen zellulären Organisation, die in Epithelzellen beschrieben wurde, die aktive Zellumlagerungen durchlaufen, was darauf hindeutet, dass das atrioventrikuläre Kanalendokard während der Klappenentwicklung eine dynamische zelluläre Umlagerung erfuhr. Eine Lernkurve ist notwendig, um ein Experte in dieser Technik zu werden. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, Sovereign Pinzette und Wolframdraht zu verwenden.
Heute war die Visualisierung des prävalvulären Endokards auf Querschnitte beschränkt. Unser Ansatz bietet die Möglichkeit, das embryonale valvuläre Endokardverhalten aus planarer Sicht zu untersuchen.
