Этот протокол позволяет проводить анализ примитивного эндокарда в плоскостной ориентации. Мы можем проанализировать распределение клеток эндокарда, анизотропию других предписаний и описать форму одной эндокардиальной клетки во время развития клапана. По сравнению с классическими тканевыми срезами, визуализация лица регенеративной области внутреннего клапана позволяет анализировать полярность плоских клеток и динамику клеток эндокарда при развитии клапана у интактных эмбрионов.
Этот метод может быть использован для углубления знаний о полярности плоских клеток во время кардиоразвития. Начните с помещения матки, иссеченной у усыпленных беременных мышей, в чашку Петри, содержащую ледяной ПБТ. Удалите индивидуальную децидуйку из матки под рассекающим микроскопом с помощью тонких щипцов.
Используя тонкий пинцет, сделайте разрез в белой части децидуа, где находится эмбрион. Аккуратно удалите его, избегайте вытягивания и перенесите эмбрионы в новую чашку Петри со свежим ПБТ, используя P-1000 с отрезанным наконечником, оставив диаметр, достаточно большой, чтобы эмбрион мог пройти, не ломаясь. Для генотипирования возьмите небольшой кусочек желточного мешочка примерно 0,5 квадратных миллиметра или кусочек хвоста от заднего конца, считая от пяти до 10 сомитов по направлению к голове и переварите его в 100 миллилитрах соответствующего буфера.
Под вытяжным капюшоном перенесите эмбрионы в ледяной холод 4% PFA в двухмиллилитровой микроцентрифужной трубке при четырех градусах Цельсия. Зафиксируйте эмбрионы от двух часов до ночи при четырех градусах Цельсия на нутриторе. Под вытяжной капюшоном извлеките фиксатор 4% PFA из микроцентрифужных трубок, не касаясь эмбрионов.
Выбросьте PFA в соответствующий контейнер. Промыть эмбрионы пять раз в холодном ПБТ в течение 10 минут при комнатной температуре. Используя тонкие щипцы, удалите сердце и перенесите его в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку со свежим ПБТ.
Замените PBT на PBS Triton и промывайте образцы трижды, по пять минут каждый, при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Заменить PBS Triton блокирующим раствором, содержащим PBS Triton с 10% термоинактивированной бычьей сывороткой. Насиживайте от двух часов до ночи при четырех градусах Цельсия на орбитальном шейкере.
Замените блокирующий раствор блокирующим раствором, содержащим первичные антитела в нужной концентрации. Насиживайте ночью на орбитальном шейкере при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия инкубируют образцы в течение 1,5 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
Этот шаг имеет решающее значение для увеличения отношения сигнал/шум. Удалите и сохраните раствор первичного антитела при четырех градусах Цельсия, до трех будущих экспериментов. Добавьте азид натрия до конечной концентрации 0,02% для лучшего сохранения.
Затем трижды промойте эмбрионы PBS Triton в течение трех минут каждый. Промыть эмбрионы PBS Triton трижды в течение 30 минут и держать их на орбитальном шейкере при четырех градусах Цельсия. После последней промывки добавляют один миллилитр блокирующего раствора, содержащего флуоресцентно-конъюгированное вторичное антитело против первичного антитела-хозяина.
Затем добавьте DAPI в раствор и высиживайте эмбрионы в течение ночи на орбитальном шейкере при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия инкубируют эмбрионы в течение 1,5 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Этот шаг необходим для увеличения отношения сигнал/шум.
Повторите шаги промывки PBS Triton, как указано в тексте рукописи. Положите сердечки на 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую PBS. Используя вольфрамовую проволоку и тонкие щипцы, изолируйте атриовентрикулярный канал или отток и разрезайте их продольно.
Подготовьте крышки, слайды, щипцы, пипетку P-200 с соответствующими наконечниками, бумажное полотенце и любые водные монтажные среды на основе глицерина для флуоресценции без DAPI. Наклейте две полоски ленты на слайд, разделенный от 0,3 до 0,6 сантиметра, чтобы создать пространство 3D-комнаты, которое позволит образцам сохранить свою первоначальную форму, не раздавливая их. Затем, используя приблизительно 20 микролитров буфера, осторожно опустите образцы на слайд между ленточными полосами, используя разрезанный наконечник пипетки P-200.
Используйте рассекающий микроскоп для повышения точности. Используя тонкие щипцы, поместите образцы эндокардом вверх, а миокард вниз на слайд. Удалите излишки PBS бумажным полотенцем и избегайте прикосновения к образцу.
Затем высушите образцы в течение одной-двух минут при комнатной температуре, чтобы образцы прилипли к слайду. Добавьте в ткань 40 микролитров монтажной среды на водной основе. Поместите крышку поверх двух кусков ленты и медленно опустите ее на ткань с помощью иглы или щипцов.
Избегайте создания пузырьков воздуха. Запечатайте крышку, используя одну каплю лака для ногтей на каждой вершине крышки. Как только лак для ногтей высохнет, очистите лишние монтажные материалы с боковых сторон крышки с помощью абсорбирующего бумажного полотенца.
Избегайте перемещения крышки. Добавьте лак для ногтей вдоль краев крышки, чтобы полностью запечатать ее, предотвращая испарение монтажной среды. Используя вертикальный или перевернутый конфокальный микроскоп, делайте снимки с 10-кратным увеличением для общего обзора и в 63 раза с 3-кратным зумом для получения подробных изображений.
Клеточную форму эндокарда анализировали при образовании клапанов при клеточном разрешении. Одиночные клетки или клоны нескольких клеток экспрессировали GFP в эндокарде. Экспрессия и комбинация GFP с субклеточной локализацией VE-кадгерина была эффективным подходом к изучению взаимосвязи между динамикой AJ и образованием филоподий и клетками до EMT, поскольку у этих клеток развились протрузии мембраны при растворении AJ.
Различия в интенсивности окрашивания VE-кадгерина в эндокарде свидетельствовали о наличии анизотропной сократимости в эмбриональном эндокарде атриовентрикулярного канала на предклапанных стадиях. Все сердце было окрашено антителом к VE-кадгерину на E8.5 и E9.5. При Е8.5 эндокард атриовентрикулярного канала имел тенденцию иметь стабильную эпителиальную организацию, а вершины, образованные более чем четырьмя клетками, не были обнаружены.
При E9.5 наблюдались вершины до шести клеток, образующие розеткоподобные структуры, подобные клеточной организации, ранее описанной в эпителиале, претерпевающей активные клеточные перестройки, предполагая, что эндокард атриовентрикулярного канала претерпевает динамическую клеточную перестройку во время развития клапана. Кривая обучения необходима, чтобы стать экспертом в этой технике. Кроме того, настоятельно рекомендуется использовать суверенные щипцы и вольфрамовую проволоку.
Сегодня визуализация предклапанного эндокарда ограничивалась поперечными сечениями. Наш подход дает возможность изучать поведение эмбрионального клапанного эндокарда с плоской точки зрения.
