Este protocolo permite a análise do endocárdio primitivo em orientação plana. Podemos analisar a distribuição das células endocárdicas, a anisotropia de outras injunções e descrever a forma de uma única célula endocárdica durante o desenvolvimento valvar. Em comparação com as seções de tecido clássicas, a imagem en face da região regenerativa da válvula interna permite a análise da polaridade e dinâmica das células planares das células endocárdicas durante o desenvolvimento valvar em embriões intactos.
Este método pode ser usado para aprofundar o conhecimento da polaridade das células planares durante o desenvolvimento cardio. Comece colocando o útero extirpado de ratas grávidas eutanasiadas numa placa de Petri contendo PBT gelado. Remova o deciduye individual do útero sob um microscópio de dissecação usando pinça fina.
Usando pinças finas, faça uma incisão na parte branca da decídua, que é onde o embrião está. Removê-lo suavemente, evite puxar e transfira os embriões para uma nova placa de Petri com PBT fresco usando um P-1000 com a ponta cortada, deixando um diâmetro grande o suficiente para um embrião passar sem quebrar. Para a genotipagem, pegue um pequeno pedaço do saco vitelino de aproximadamente 0,5 milímetros quadrados ou um pedaço da cauda da extremidade posterior, contando cinco a 10 somitos em direção à cabeça e digere-o em 100 mililitros do tampão apropriado.
Sob o exaustor, transfira os embriões para 4% de PFA gelado em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros a quatro graus Celsius. Fixe os embriões de duas horas a noite a quatro graus Celsius em um nutator. Sob o exaustor, remova o fixador de 4% de PFA dos tubos de microcentrífuga sem tocar nos embriões.
Rejeitar o PFA num recipiente adequado. Lave os embriões cinco vezes em PBT frio durante 10 minutos à temperatura ambiente. Usando pinça fina, remova o coração e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com PBT fresco.
Substitua o PBT pelo PBS Triton e lave as amostras três vezes, cinco minutos cada, à temperatura ambiente em um agitador orbital. Substitua o PBS Triton por uma solução de bloqueio contendo PBS Triton por soro bovino inativado pelo calor a 10%. Incubar de duas horas para a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital.
Substitua a solução de bloqueio por uma solução de bloqueio contendo anticorpos primários na concentração desejada. Incubar durante a noite em um agitador orbital a quatro graus Celsius. Após incubação durante a noite a quatro graus Celsius, incubar as amostras por 1,5 horas à temperatura ambiente em um agitador orbital.
Esta etapa é crucial para aumentar a relação sinal-ruído. Remova e mantenha a solução primária de anticorpos a quatro graus Celsius, até três experimentos futuros. Adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% para uma melhor conservação.
Em seguida, lave os embriões três vezes com PBS Triton por três minutos cada. Lave os embriões com PBS Triton três vezes por 30 minutos e mantenha-os em um agitador orbital a quatro graus Celsius. Após a última lavagem, adicionar um mililitro de solução bloqueadora contendo anticorpo secundário conjugado com fluorescência contra a espécie hospedeira de anticorpos primários.
Em seguida, adicione DAPI à solução e incube os embriões durante a noite em um agitador orbital a quatro graus Celsius. Após a incubação noturna a quatro graus Celsius, incubar os embriões por 1,5 horas à temperatura ambiente em um agitador orbital. Esta etapa é essencial para aumentar a relação sinal-ruído.
Repita as etapas de lavagem do PBS Triton, conforme mencionado no manuscrito do texto. Coloque os corações em uma placa de Petri de 35 milímetros contendo PBS. Usando um fio de tungstênio e pinça fina, isole o canal atrioventricular ou a via de saída e corte-os longitudinalmente.
Prepare folhas de cobertura, lâminas, pinças, uma pipeta P-200 com as pontas apropriadas, uma toalha de papel e qualquer meio de montagem aquoso à base de glicerol para fluorescência sem DAPI. Cole duas tiras de fita adesiva em uma lâmina separada por 0,3 a 0,6 centímetros para criar um espaço de sala 3D que permitirá que as amostras conservem sua forma original sem esmagá-las. Em seguida, usando aproximadamente 20 microlitros de buffer, solte cuidadosamente as amostras no slide entre as tiras de fita usando uma ponta de pipeta P-200 cortada.
Use um microscópio de dissecação para aumentar a precisão. Usando pinça fina, coloque as amostras com o endocárdio voltado para cima e o miocárdio para baixo na lâmina. Remova o excesso de PBS com uma toalha de papel e evite tocar na amostra.
Em seguida, seque as amostras por um a dois minutos à temperatura ambiente para fazer com que as amostras grudem na lâmina. Adicione 40 microlitros de meios de montagem à base de água ao tecido. Coloque a tampa deslize sobre os dois pedaços de fita adesiva e abaixe-a lentamente sobre o tecido com uma agulha ou pinça.
Evite criar bolhas de ar. Sele a folha da tampa usando uma gota de esmalte em cada vértice da folha da tampa. Uma vez que o esmalte esteja seco, limpe o meio de montagem em excesso dos lados da tampa deslizando usando uma toalha de papel absorvente.
Evite mover o deslizamento da tampa. Adicione esmalte ao longo das bordas deslizantes da tampa para selá-la completamente, evitando a evaporação do meio de montagem. Usando um microscópio confocal vertical ou invertido, tire imagens com ampliação de 10X para visualização geral e em 63X com zoom de 3X para imagens detalhadas.
A forma celular do endocárdio foi analisada durante a formação das válvulas em resolução celular. Células únicas ou clones de algumas células expressaram GFP no endocárdio. A expressão de GFP e a combinação com a localização subcelular VE-caderina foi uma abordagem eficaz para estudar a relação entre a dinâmica de AJ e a formação de filópodes e as células pré-EMT, uma vez que essas células desenvolveram saliências de membrana à medida que os AJs se dissolvem.
Diferenças na intensidade da coloração com VE-caderina no endocárdio indicaram a presença de contratilidade anisotrópica no endocárdio embrionário do canal atrioventricular nos estágios pré-valvares. Todo o coração foi corado com o anticorpo VE-caderina em E8.5 e E9.5. Em E8,5, o endocárdio do canal atrioventricular tendeu a ter uma organização epitelial estável, e vértices formados por mais de quatro células não foram detectados.
Em E9,5, foram observados vértices de até seis células formando estruturas semelhantes a rosetas, semelhantes à organização celular descrita anteriormente no epitelial submetido a rearranjos celulares ativos, sugerindo que o endocárdio do canal atrioventricular estava passando por rearranjo celular dinâmico durante o desenvolvimento valvar. Uma curva de aprendizado é necessária para se tornar um especialista nessa técnica. Além disso, é altamente recomendável usar pinça soberana e fio de tungstênio.
Hoje, a visualização do endocárdio pré-valvar limitava-se aos cortes transversais. Nossa abordagem oferece a possibilidade de estudar o comportamento do endocárdio valvar embrionário de um ponto de vista planar.
