Bu protokol, ilkel endokardın düzlemsel bir oryantasyonda analiz edilmesini sağlar. Endokardiyal hücrelerin dağılımını, diğer emirlerin anizotropisini analiz edebilir ve kapak gelişimi sırasında tek bir endokardiyal hücrenin şeklini tanımlayabiliriz. Klasik doku kesitleri ile karşılaştırıldığında, iç kapak rejeneratif bölgesinin en yüz görüntülemesi, bozulmamış embriyolarda kapak gelişimi sırasında endokardiyal hücrelerin düzlemsel hücre polaritesinin ve dinamiklerinin analizine olanak sağlar.
Bu yöntem, kardiyo gelişimi sırasında düzlemsel hücre polaritesi bilgisini derinleştirmek için kullanılabilir. Ötanize hamile farelerden eksize edilen uterusu, buz gibi soğuk PBT içeren bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. İnce forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altında bireysel desidüyü uterustan çıkarın.
İnce cımbız kullanarak, embriyonun bulunduğu yer olan decidua'nın beyaz kısmında bir kesi yapın. Yavaşça çıkarın, çekmekten kaçının ve embriyoları, ucu kesilmiş bir P-1000 kullanarak taze PBT'li yeni bir Petri kabına aktarın ve embriyonun kırılmadan geçmesi için yeterince büyük bir çap bırakın. Genotipleme için, yumurta sarısı kesesinin yaklaşık 0,5 milimetre kare küçük bir parçasını veya arka uçtan kuyruğun bir parçasını alın, başa doğru beş ila 10 somit sayın ve uygun tamponun 100 mililitresinde sindirin.
Duman başlığının altında, embriyoları dört santigrat derecede iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde buz gibi soğuk% 4 PFA'ya aktarın. Embriyoları bir nutator üzerinde iki saatten bir geceye dört santigrat derecede sabitleyin. Duman başlığının altında, embriyolara dokunmadan mikrosantrifüj tüplerinden% 4 PFA fiksatifini çıkarın.
PFA'yı uygun bir kaba atın. Embriyoları soğuk PBT'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca beş kez yıkayın. İnce forseps kullanarak kalbi çıkarın ve taze PBT'li yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
PBT'yi PBS Triton ile değiştirin ve numuneleri yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında her biri beş dakika olmak üzere üç kez yıkayın. PBS Triton'u, %10 ısıda inaktive edilmiş sığır serumu içeren PBS Triton içeren bir blokaj çözeltisi ile değiştirin. Yörüngesel bir çalkalayıcıda iki saatten gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Bloke edici çözeltiyi, istenen konsantrasyonda birincil antikor içeren blokaj çözeltisi ile değiştirin. Dört santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Dört santigrat derecede gece inkübasyonundan sonra, numuneleri yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.
Bu adım, sinyal-gürültü oranını artırmak için çok önemlidir. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve gelecekteki üç deneye kadar dört santigrat derecede tutun. En iyi koruma için% 0.02'lik bir son konsantrasyona sodyum azid ekleyin.
Ardından, embriyoları PBS Triton ile her biri üç dakika boyunca üç kez yıkayın. Embriyoları PBS Triton ile 30 dakika boyunca üç kez yıkayın ve dört santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda tutun. Son yıkamadan sonra, birincil antikor konakçı türlerine karşı floresan konjuge sekonjuge sekonder antikor içeren bir mililitre bloke edici çözelti ekleyin.
Daha sonra çözeltiye DAPI ekleyin ve embriyoları gece boyunca dört santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin. Dört santigrat derecede gece inkübasyonundan sonra, embriyoları yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin. Bu adım, sinyal-gürültü oranını artırmak için gereklidir.
PBS Triton yıkama adımlarını metin yazısında belirtildiği gibi tekrarlayın. Kalpleri PBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına koyun. Bir tungsten tel ve ince forseps kullanarak, atriyoventriküler kanalı veya çıkış yolunu izole edin ve uzunlamasına kesin.
DAPI'siz floresan için kapak fişleri, slaytlar, forsepsler, uygun uçlara sahip bir P-200 pipeti, bir kağıt havlu ve sulu gliserol bazlı montaj ortamları hazırlayın. Numunelerin ezmeden orijinal şekillerini korumalarını sağlayacak bir 3B oda alanı oluşturmak için 0,3 ila 0,6 santimetre arasında ayrılmış bir slayta iki bant şeridi yapıştırın. Daha sonra, yaklaşık 20 mikrolitre tampon kullanarak, kesilmiş bir P-200 pipet ucu kullanarak numuneleri bant şeritleri arasındaki slayda dikkatlice bırakın.
Doğruluğu artırmak için diseksiyon mikroskobu kullanın. İnce forseps kullanarak, örnekleri endokardiyumu yukarı bakacak ve miyokard aşağı bakacak şekilde slaytın üzerine yerleştirin. Fazla PBS'yi kağıt havluyla çıkarın ve numuneye dokunmaktan kaçının.
Ardından, numunelerin slayda yapışmasını sağlamak için numuneleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika kurulayın. Mendile 40 mikrolitre sulu bazlı montaj ortamı ekleyin. Kapak kaymasını iki bant parçasının üzerine yerleştirin ve bir iğne veya forseps ile yavaşça dokuya indirin.
Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Kapak kaymasını, kapak kaymasının her köşesine bir damla oje kullanarak kapatın. Oje kuruduktan sonra, emici bir kağıt havlu kullanarak kapak kaymasının kenarlarındaki fazla montaj ortamını temizleyin.
Kapak kaymasını hareket ettirmekten kaçının. Kapağı tamamen kapatmak için kapak kayma kenarları boyunca oje ekleyerek montaj ortamının buharlaşmasını önleyin. Dik veya ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak, genel görünüm için 10X büyütmede ve ayrıntılı görüntüler için 3X yakınlaştırma ile 63X'te görüntüler çekin.
Endokardın hücre şekli, kapakçıkların hücresel çözünürlükte oluşumu sırasında analiz edildi. Tek hücreler veya birkaç hücrenin klonları endokardda GFP'yi eksprese etti. GFP ekspresyonu ve VE-kadherin hücre altı lokalizasyonu ile kombinasyon, AJ dinamiği ile filopodia oluşumu ve EMT öncesi hücreler arasındaki ilişkiyi incelemek için etkili bir yaklaşımdı, çünkü bu hücreler AJ'ler çözülürken membran çıkıntıları geliştirdi.
Endokarddaki VE-kadherin boyamasının yoğunluğundaki farklılıklar, pre-valvüler aşamalarda atriyoventriküler kanalın embriyonik endokardında anizotropik kontraktilitenin varlığını göstermiştir. Tüm kalp E8.5 ve E9.5'te VE-kadherin antikoru ile boyandı. E8.5'te, atriyoventriküler kanalın endokardının stabil bir epitel organizasyonuna sahip olma eğilimindeydi ve dörtten fazla hücre tarafından oluşturulan köşeler tespit edilmedi.
E9.5'te, altı hücreye kadar olan köşelerin, daha önce aktif hücre yeniden düzenlemelerinden geçen epitelyalde tarif edilen hücresel organizasyona benzer şekilde rozet benzeri yapılar oluşturduğu gözlendi, bu da atriyoventriküler kanal endokardının kapak gelişimi sırasında dinamik hücresel yeniden düzenlemeye uğradığını düşündürdü. Bu teknikte uzman olmak için bir öğrenme eğrisi gereklidir. Ayrıca, Sovereign forseps ve tungsten tel kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Günümüzde prevalvüler endokardın görüntülenmesi kesitlerle sınırlıydı. Yaklaşımımız, embriyonik kapak endokardiyumu davranışını düzlemsel bir bakış açısıyla inceleme imkanı sunmaktadır.
