El protocolo es muy importante porque permite el uso rápido, fácil y directo de plantillas de ADN lineal en sistemas de síntesis de proteínas libres de células, incluso a partir de parámetros nativos de E. coli. Las principales ventajas son la cantidad de tiempo ahorrada al evitar la clonación, las modificaciones químicas de los extremos lineales del ADN y los suplementos protectores como el ADN gamma o chi. A medida que se desarrollan extractos de síntesis autoinformados para diferentes organismos de interés, nuestro método presenta una forma de acelerar la creación de prototipos en esos extractos mediante el uso de ADN lineal.
Para comenzar, raye la cepa BL21 Rosetta-2 delta recBCD desde menos 80 grados centígrados de glicerol en una placa de agar 2x YTP que contiene 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Luego, inocular una sola colonia de la placa de agar en un poco más de 40 mililitros de 2x YTP suplementado con 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incubar durante la noche a 37 grados centígrados con agitación de 200 RPM. Luego, haga un subcultivo diluyendo el cultivo durante la noche 100 veces en cuatro litros de medios frescos 2x YTP que contienen 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol.
Divida los cuatro litros de los medios en cuatro matraces separados. Incubar a 37 grados centígrados, 200 RPM, durante aproximadamente tres a cuatro horas de crecimiento para alcanzar una densidad óptica de 1.5 a 2.0. Ponga el cultivo en hielo, gire las células a 5, 000 G durante 12 minutos a cuatro grados centígrados, y luego deseche el sobrenadante por decantación.
Luego, resuspender los pellets de celda en 800 mililitros de S30A refrigerado con TDT. Nuevamente, gire las células a 5, 000 G durante 12 minutos a cuatro grados Celsius como se demostró anteriormente y deseche el sobrenadante por decantación. Después de resuspender los gránulos de células en 160 mililitros de S30A refrigerado con TDT, transfiera las células a tubos de 50 mililitros refrigerados y previamente pesados.
Haga girar las células a 2000 G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados y luego desechar el sobrenadante por decantación. Una vez más, gire las células a 2000 G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados, y luego retire el sobrenadante restante con cuidado usando una pipeta. Luego, vuelva a medir el peso del tubo para calcular el peso del pellet de celda y mantenga los gránulos de celda a menos 80 grados centígrados.
Después de tomar los gránulos de celda de menos 80 grados centígrados, descongelarlos en hielo durante una o dos horas y resuspender los gránulos de celda en 0.9 mililitros de S30A con tampón de TDT por gramo del peso del pellet de celda. Luego, pipetear lentamente para resuspender las células, evitando la espuma superior tanto como sea posible. Coloque alícuotas de un mililitro de las células resuspendidas en microtubos de 1,5 mililitros y manténgalas en hielo o en un bloque frío preenfriado a cuatro grados centígrados.
A continuación, sonicar cada tubo en un sonicador con una configuración de 20% de amplitud durante tres ciclos y girar el lisado a 12, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de recoger el sobrenadante con una pipeta, transfiera a un tubo de 50 mililitros. Incubar el lisado celular a 37 grados centígrados a 200 RPM agitación durante 80 minutos.
Después de girar el lisado y recoger el sobrenadante en microtubos de 1,5 mililitros preenfriados, alícuota 30 microlitros en tubos de PCR de 8 tiras preenfriados, manteniendo todos los tubos en hielo. Congele rápidamente las alícuotas de lisado en hielo seco y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con la pestaña de preparación del búfer como se describe en el manuscrito.
Para un volumen de reacción de 10,5 microlitros, agregue 1,05 microlitros de diferentes concentraciones de Mg-glutamato y 9,45 microlitros de la mezcla maestra y mezcle suavemente. Pipetear 10 microlitros de las reacciones anteriores en una microplaca de fondo cuadrado de 384 pocillos y cubrirla con un sello de placa adhesiva. Mida la expresión génica como salida de fluorescencia registrando datos de fluorescencia con un lector de placas a intervalos regulares durante ocho horas de incubación a 30 grados centígrados con agitación orbital continua a 307 ciclos por minuto.
Después de identificar la concentración de Mg-glutamato que resulta en el valor de fluorescencia más alto en el punto final, proceda a la calibración de K-glutamato. Ejecute el experimento e identifique el valor de fluorescencia más alto de entre las concentraciones de K-glutamato probadas, identificando así la composición tampón óptima para Mg-glutamato y K-glutamato para este lisado. Una vez establecidos los valores de Mg-glutamato y K-glutamato, preparar tubos madre de la composición tampón optimizada según el volumen de lote obtenido.
Después de calcular el número de tubos amortiguadores necesarios, alícuota 38 microlitros por tubo y guárdelos a menos 80 grados centígrados. Primero, etiquete un microtubo de 1.5 mililitros para la preparación óptima de la mezcla maestra. Agregue los volúmenes correctos del tampón y el lisado y mezcle suavemente.
Luego, pipetear primero las muestras de ADN, seguidas de agua libre de nucleasas y, finalmente, la mezcla maestra óptima. Mezcle suavemente la reacción sin células con una pipeta justo antes de añadirla al lector de placas y evite cualquier burbuja. Después de configurar las reacciones en el lector de placas, las ejecuciones cinéticas registraron datos de fluorescencia a intervalos regulares durante ocho horas de incubación a 30 grados centígrados con agitación orbital continua a 307 ciclos por minuto.
Después de la calibración del lisado, la concentración óptima de Mg-glutamato fue similar a ocho milimolares a través de extractos para ADN lineal y plásmido. Sin embargo, la concentración óptima de K-glutamato para el ADN plásmido es de 140 milimolar, mientras que la concentración óptima de K-glutamato para el ADN lineal es de 20 milimolar. Después de los pasos de calibración, los niveles de expresiones de GFP se compararon entre el ADN lineal y plásmido en los extractos de tipo salvaje, delta recB y delta recBCD.
La expresión de GFP del ADN lineal alcanzó el 102% y el 138% de la expresión del ADN plásmido en extractos de cepas delta recB y delta recBCD, respectivamente. Las cosas más importantes en el protocolo son la lisis de sonicación de la célula y los pasos de calibración del tampón por separado para el ADN lineal y plásmido, particularmente cuando se usan los parámetros nativos. Esta técnica ayudaría a acelerar las pruebas de diseños biológicos en sistemas libres de células, por ejemplo, la detección de biosensores, enzimas y vías, o la creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos.
