Bu protokol, pasajsız üretilen hafıza epitel organoidlerinin üretimi için önemlidir. Bu tekniğin temel avantajı, organoidlerin enzimatik sindirimden sonra insan ve fare göğsünden ve hafıza dokusundan izole edilebilmesidir. Epitel organoidlerini hücrelerden geçmek zorunda kalmadan izole eden bir dizi diferansiyel santrifüjleme adımı gerçekleştiriyoruz.
Bu tekniği uygulayan bir kişi, dokuları kollajen veya matrise gömerken ve bunları 96 delikli bir plaka içine yerleştirirken zorluklarla karşılaşabilir. Ayrıca, düzgün polimerize kollajen kullanmak ve stabil kubbeleri kaplamak, istilayı görmenin anahtarıdır. Başlamak için, fare uzuvlarını oynatarak ve dört adet 19 gauge iğne kullanarak ötenazi yapılmış bir farenin meme dokusunu toplayın, fareyi pençelerinden ventral tarafı yukarı bakacak şekilde emici bir ped ile kaplı bir tahtaya sabitleyin.
Kürkü yumuşatmak ve cildi sterilize etmek için% 70 etanol ile püskürtün ve dışkıyı bir gazlı bez pedi veya mendille silin. Anogenital bölgenin hemen üstünden başlayarak, periton boyunca delinmemeye özen göstererek cerrahi makas kullanarak orta hattan yukarı doğru kesin. Çeneye ulaştıktan sonra, hem klavikulaları hem de arka bacakları aşağı doğru yanal kesikler yapın ve meme yağ pedlerini ortaya çıkarmak için farenin derisini tahtaya sabitleyin.
Kasık ve torasik meme yağ pedlerini vahşi tip farelerde bulduktan sonra, meme yağ yastığını yükseltmek için forseps kullanın. Keskin künt makasların künt ucunu kullanarak, meme yağ yastığının altında deriden uzakta bir cep oluşturun ve meme yağ yastığını tek bir parça halinde kesin. Meme yağ yastıkları çıkarıldıktan sonra, steril bir doku kültürü kabına yerleştirmeden önce PBS'de durulayın ve ardından hızlı bir şekilde bir doku kültürü başlığına aktarın.
Meme tümörlerini 10 veya 11 numaralı neşter ile kıyarak macun benzeri bir kıvama ulaşana kadar dokuyu gevşetin. Kıyılmış dokuyu bir neşter kullanarak 10 ila 30 mililitre kollajenaz çözeltisi içeren konik bir tüpe aktarın. Tüm dokuların toplandığından emin olmak için, doku kültürü plakasına bir mililitre kollajenaz çözeltisi pipetleyin ve konik tüpe geri koyun.
Konik tüpü, doku gerginleşene ve kollajenaz çözeltisi bulanıklaşana kadar tezgah üstü çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin. 1.500 RPM'de beş ila 10 dakika boyunca 50 mililitre çözeltiyi döndürün. Süpernatan aspire edin ve bazal ortamın 12 mililitresini ekleyin ve üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, tüpü 15 kez tutarken bileği hafifçe döndürerek karıştırın.
Yine, aspirat süpernatan aşağı doğru döndürün, bazal ortam ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi pipetleme veya tüp rotasyonu ile karıştırın. En ağır doku parçaları dibe yerleştikten sonra, süpernatantı serolojik bir pipetle toplar ve 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarır. Her santrifüjlemeden sonra, peletin giderek daha opak hale geldiğinden emin olun.
Aliquot, organoidlerin kuyu başına BECM miktarına göre organoid yoğunluğuna göre mikrosantrifüj tüplerine uygun süspansiyonu. Mikrosantrifüj tüplerini oda sıcaklığında 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı tüplerden atın. Tüpleri organoid peletlerle buza taşıyın ve her mikrosantrifüj tüpüne uygun miktarda BECM ekleyin.
BECM'deki organoidleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, kabarcık üretmemeye dikkat edin. BECM asılı organoidleri yavaşça ve dikkatli bir şekilde kaplama yüzeyine pipetleyin ve nemi korumak için tüm boş kuyucukları PBS ile doldurun. BECM'nin katılaşmasına izin vermek için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve ardından uygun ortam hacmiyle örtün.
Kollajen çözeltisini hazırlamak için, DMEM konsantrasyonunun 10 katı 375 mikrolitreyi, 100 mikrolitre normal sodyum hidroksit ve üç mililitre sıçan kuyruğu kollajen I çözeltisini 15 mililitrelik bir konik tüpte birleştirin. Pipet karışımı, kabarcıklar yapmamaya dikkat edin ve çözeltiyi az miktarda sodyum hidroksit veya gerektiğinde DMEM konsantrasyonunun 10 katı ile 7.2 ila 7.4 pH değerine titre edin. Kuyucukların dibini, az miktarda kolajen yerleştirerek kuyunun tabanını tamamen örtmek için gereken minimum miktarda kolajen ile kaplayın ve plakayı bir yandan diğer tarafa doğru sallayın.
Kollajen altlıklarının 30 dakika ila iki saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmasına izin verin. Aliquot, organoidlerin mikrosantrifüj tüplerine uygun süspansiyonunu, kuyu başına kollajen miktarına göre organoid yoğunluğuna göre alır. Kollajen çözeltisini dört santigrat derecede saklayın ve her 10 dakikada bir mikroskop altında lif oluşumunu kontrol ederek polimerizasyonu izleyin.
Mikrosantrifüj tüplerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın ve süpernatantı tüplerden atın. Organoid peletleri buza taşıyın ve her mikrosantrifüj tüpüne uygun miktarda kollajen ekleyin. Kollajendeki organoidleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, kabarcık üretmemeye dikkat edin.
Kollajen asılı organoidleri yavaşça ve dikkatli bir şekilde kaplama yüzeyine pipetleyin. Bodrum katındaki hücre dışı matriks veya kollajendeki gömülü organoidlerin immünofloresan görüntüleri, türler arası doku kompozisyonu benzerliklerini incelemek için elde edildi. Kollajen matrisine gömülü organoidler bir istila testi için kullanılabilir ve membran domates etiketlemesi veya aktinin falloidin boyanması yoluyla organoidin kendisinden dallanan dalların genişlemesini izleyerek analiz edilebilir.
Son olarak, parafin gömülü organoidlerin hematoksilin ve eozin boyaması, organoidlerin meme kanserinin aynı histolojisini koruduğunu göstermektedir. Erken polimerizasyonu önlemek için jelleşmiş kubbeleri pipetlerken BECM ve kollajeni soğuk tutmak çok önemlidir. Ek olarak, PFA'daki kubbelerin uzun süre sabitlenmesi, immünofloresan boyama yapılırsa jelleşmiş çözeltiye yol açacaktır.
Organoidler ayrıca ilaç ekranları ve metastazın fare modelleri gibi in vitro ve in vivo prosedürlerde de kullanılabilir. Bu yöntemler, tümör dokusunun terapötik duyarlılığı, metastatik özellikleri ve immün etkileşimleri hakkında fikir verebilir.
