פרוטוקול זה משמעותי לייצור אורגנואידים אפיתליאליים של זיכרון הנוצרים ללא מעבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד אורגנואידים מרקמת השד והזיכרון של האדם והעכבר לאחר עיכול אנזימטי. אנו מבצעים סדרה של צעדי צנטריפוגה דיפרנציאליים המבודדים אורגנואידים אפיתליאליים ללא צורך לעבור תאים.
אדם המבצע טכניקה זו עלול להיתקל באתגרים בעת הטמעת הרקמות בקולגן או במטריצה וציפוין בתוך צלחת של 96 בארות. יתר על כן, שימוש בקולגן פולימרי כראוי וציפוי כיפות יציבות הוא המפתח לפלישה. כדי להתחיל, לאסוף את רקמת החלב של עכבר שעבר המתת חסד על ידי משחק גפיים עכבר באמצעות ארבע מחטים 19 מד, הצמד את העכבר על ידי הכפות ללוח מכוסה כרית סופג עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה.
יש לרסס באתנול 70% כדי להחליק את הפרווה ולחטא את העור ולנגב את הצואה בעזרת פד גזה או רקמה. מתחילים ממש מעל האזור האנוגניטלי, חותכים כלפי מעלה מקו האמצע באמצעות מספריים כירורגיים תוך הקפדה לא לחדור דרך הצפק. עם ההגעה לסנטר, בצעו חתכים רוחביים במורד שתי עצמות הבריח ובמורד הרגליים האחוריות והצמידו את עור העכבר מתוח ללוח כדי לחשוף רפידות שומן חלב.
לאחר איתור רפידות שומן החלב המפשעות והחזה על עכברי בר, השתמשו במלקחיים כדי להעלות את כרית שומן החלב. בעזרת הקצה הקהה של מספריים חדים וקהים, צרו כיס מתחת לכרית שומן החלב הרחק מהעור וחתכו את כרית שומן החלב בחתיכה אחת שלמה. לאחר הסרת רפידות שומן החלב, יש לשטוף ב-PBS לפני הכנסתן לצלחת תרבית רקמה סטרילית ולאחר מכן להעביר במהירות למכסה מנוע של תרבית רקמות.
טחנו את גידולי החלב עם אזמל מספר 10 או מספר 11 כדי לשחרר את הרקמה עד שהיא מגיעה למרקם דמוי משחה. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור חרוטי המכיל 10 עד 30 מיליליטר של תמיסת collagenase באמצעות אזמל. כדי להבטיח שכל הרקמה נאספת, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת collagenase על צלחת תרבית הרקמה ובחזרה לתוך הצינור החרוט.
הכניסו את הצינור החרוטי לאינקובטור ניעור ספסל עד שהרקמה הופכת למחוטבת ותמיסת הקולגנאז הופכת לעכורה. סובב למטה 50 מיליליטר של פתרון במשך חמש עד 10 דקות ב 1, 500 סל"ד. שאפו סופרנטנט, הוסיפו 12 מיליליטר של המדיום הבסיסי וערבבו על ידי פיטום למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים או סובבו בעדינות את פרק כף היד תוך כדי החזקת הצינור 15 פעמים.
שוב, לסובב כלפי מטה את השאיפה הסופרנטית, להוסיף מדיום בזאלי, ולערבב על ידי פיפטינג או סיבוב צינור כפי שהודגם קודם לכן. ברגע ששברי הרקמה הכבדים ביותר מתיישבים לתחתית, אוספים את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית ומעבירים אותו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר כל צנטריפוגה, ודא כי הגלולה הופכת אטומה יותר ויותר.
Aliquot מתאים השעיה של אורגנואידים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות על פי צפיפות האורגנואידים ביחס לכמות BECM לכל באר. צנטריפוגות את צינורות המיקרו-צנטריפוגות למשך 10 דקות ב-300 גרם בטמפרטורת החדר ומשליכים את הסופרנאטנט מהצינורות. העבר את הצינורות עם כדורי אורגנואיד לקרח והוסף את הנפח המתאים של BECM לכל צינור מיקרוצנטריפוגה.
פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את האורגנואידים ב- BECM, תוך הקפדה לא לייצר בועות. לאט ובזהירות מחזירים את האורגנואידים המרחפים של BECM על משטח הציפוי וממלאים את כל הבארות הריקות ב-PBS כדי לשמור על לחות. הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר ל-BECM להתמצק ולאחר מכן כסו בנפח המדיה המתאים.
כדי להכין את תמיסת הקולגן, ערבבו 375 מיקרוליטר של ריכוז פי 10 של DMEM, 100 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד, ושלושה מיליליטר של תמיסת קולגן I זנב חולדה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. תערובת פיפטה, הקפדה לא ליצור בועות, וטיטראט התמיסה ל- pH של 7.2 עד 7.4 עם כמות קטנה של נתרן הידרוקסידי או פי 10 ריכוז DMEM לפי הצורך. מצפים את תחתית הבארות בכמות המינימלית של קולגן הנדרשת לכיסוי מלא של תחתית הבאר על ידי הנחת כמות קטנה של קולגן ומנדנדים את הצלחת מצד לצד לציפוי.
תנו לשכבות הקולגן להתייצב על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעתיים. Aliquot את התרחיף המתאים של אורגנואידים לתוך צינורות microcentrifuge על פי צפיפות אורגנואיד ביחס לכמות קולגן לכל באר. אחסנו את תמיסת הקולגן בארבע מעלות צלזיוס ועקבו אחר פילמור על ידי בדיקת היווצרות סיבים תחת מיקרוסקופ כל 10 דקות.
צנטריפוגות את צינורות המיקרו-צנטריפוגות ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומשליכים את הסופרנאטנט מהצינורות. העבירו את כדורי האורגנואיד לקרח והוסיפו את נפח הקולגן המתאים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות אורגנואידים בקולגן, נזהר לא לייצר בועות.
לאט ובזהירות פיפטה קולגן מרחף אורגנואידים על משטח הציפוי. התמונות האימונופלואורסצנטיות של אורגנואידים משובצים במטריצה חוץ-תאית במרתף או בקולגן התקבלו כדי לחקור את הדמיון בהרכב הרקמה בין המינים. אורגנואידים המשובצים במטריצת קולגן יכולים לשמש לבדיקת פלישה ולנתח אותם על ידי מעקב אחר התפשטות הקנוקנות המסתעפות מהאורגנואיד עצמו באמצעות סימון עגבניות בקרום או צביעת פלואדין של אקטין (actin).
לבסוף, המטוקסילין וצביעת אאוזין של אורגנואידים משובצים פרפין מראים כי אורגנואידים שומרים על אותה היסטולוגיה של סרטן השד. חשוב לשמור על קור BECM וקולגן בזמן הכנת כיפות ג'ל כדי למנוע פילמור מוקדם. בנוסף, קיבוע ממושך של כיפות ב-PFA יוביל לתמיסת ג'ל אם מבצעים צביעה אימונופלואורסצנטית.
אורגנואידים יכולים לשמש גם במבחנה ובפרוצדורות in vivo כגון מסכי תרופות ומודלים עכבריים של גרורות. שיטות אלה יכולות לספק תובנות לגבי רגישות טיפולית של רקמת גידול, תכונות גרורתיות ואינטראקציות חיסוניות.
