이 프로토콜은 계대배양 없이 생성되는 기억 상피 오가노이드의 생산에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 효소 소화 후 인간과 마우스의 유방 및 기억 조직에서 오가노이드를 분리할 수 있다는 것입니다. 우리는 세포를 통과할 필요 없이 상피 오가노이드를 분리하는 일련의 차등 원심분리 단계를 수행합니다.
이 기술을 수행하는 개인은 조직을 콜라겐 또는 매트릭스에 삽입하고 96웰 플레이트 내에 도금할 때 문제에 직면할 수 있습니다. 또한, 적절하게 중합 된 콜라겐을 사용하고 안정된 돔을 도금하는 것이 침입을 보는 열쇠입니다. 시작하려면 마우스 팔다리를 벌리고 4개의 19게이지 바늘을 사용하여 안락사된 마우스의 유방 조직을 수집하고 복부 쪽이 위쪽을 향하도록 흡수 패드로 덮인 보드에 발로 마우스를 고정합니다.
70% 에탄올을 뿌려 털을 매끄럽게 하고 피부를 소독하고 거즈 패드나 티슈로 대변을 닦아냅니다. 항문 생식기 부위 바로 위에서 시작하여 복막을 뚫지 않도록 주의하면서 수술용 가위를 사용하여 정중선에서 위쪽으로 자릅니다. 턱에 도달하면 양쪽 쇄골과 뒷다리를 옆으로 자르고 마우스의 피부를 보드에 팽팽하게 고정하여 유방 지방 패드를 노출시킵니다.
야생형 마우스에서 사타구니 및 흉부 유방 지방 패드를 찾은 후 집게를 사용하여 유방 지방 패드를 들어 올립니다. 뾰족한 뭉툭한 가위의 뭉툭한 끝을 사용하여 유방 지방 패드 아래에 피부에서 떨어진 주머니를 만들고 유방 지방 패드를 한 조각으로 잘라냅니다. 유방 지방 패드가 제거되면 멸균 조직 배양 접시에 넣기 전에 PBS로 헹구고 조직 배양 후드로 빠르게 옮깁니다.
10번 또는 11번 메스로 유방 종양을 다져서 페이스트와 같은 농도가 될 때까지 조직을 느슨하게 합니다. 메스를 사용하여 다진 조직을 10 내지 30 밀리리터의 콜라게나제 용액을 함유하는 원추형 튜브로 옮긴다. 모든 조직이 수집되도록 하기 위해 1밀리리터의 콜라게나제 용액을 조직 배양 플레이트에 피펫으로 넣고 다시 원뿔형 튜브에 넣습니다.
조직이 뻣뻣해지고 콜라게나제 용액이 흐려질 때까지 원뿔형 튜브를 탁상용 쉐이킹 인큐베이터에 넣습니다. 50 밀리리터의 용액을 1, 500 RPM에서 5 내지 10 분 동안 스핀 다운시킨다. 상층액을 흡인하고, 12 밀리리터의 기초 배지를 첨가하고, 3 내지 4회 위아래로 피펫팅하여 혼합하거나, 튜브를 15회 잡은 채로 손목을 부드럽게 회전시킨다.
다시, 흡인 상층액을 회전시키고, 기본 배지를 추가하고, 앞에서 설명한 대로 피펫팅 또는 튜브 회전으로 혼합합니다. 가장 무거운 조직 조각이 바닥에 가라앉으면 혈청학적 피펫으로 상층액을 수집하고 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 각 원심분리 후, 펠릿이 점점 불투명해지는지 확인하십시오.
오가노이드의 적절한 현탁액을 웰당 BECM의 양에 대한 오가노이드 밀도에 따라 미세원심분리 튜브에 분취합니다. 실온에서 300G에서 10분 동안 미세원심분리기 튜브를 원심분리하고 튜브에서 상층액을 버립니다. 오가노이드 펠릿이 있는 튜브를 얼음으로 옮기고 각 미세 원심분리기 튜브에 적절한 양의 BECM을 추가합니다.
기포가 생성되지 않도록 주의하면서 BECM에서 오가노이드를 다시 현탁하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 합니다. BECM 부유 오가노이드를 도금 표면에 천천히 조심스럽게 피펫팅하고 습도를 유지하기 위해 모든 빈 웰을 PBS로 채웁니다. 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 BECM이 굳을 수 있도록 한 다음 적절한 양의 배지로 덮습니다.
콜라겐 용액을 제조하기 위해, 15 밀리리터의 원뿔형 튜브에 DMEM 농도의 10 배 농도의 375 마이크로리터, 1 통상 수산화나트륨 100 마이크로리터, 및 쥐 꼬리 콜라겐 I 용액 3 밀리리터를 합친다. 피펫 믹스, 기포를 만들지 않도록 주의하면서, 용액을 필요에 따라 소량의 수산화나트륨 또는 DMEM 농도의 10배로 7.2 내지 7.4의 pH로 적정한다. 소량의 콜라겐을 배치하여 웰 바닥을 완전히 덮는 데 필요한 최소한의 콜라겐으로 웰 바닥을 코팅하고 플레이트를 좌우로 흔들어 코팅합니다.
콜라겐 밑받침이 섭씨 37도에서 30분에서 2시간 동안 설정되도록 합니다. 오가노이드의 적절한 현탁액을 웰당 콜라겐의 양에 대한 오가노이드 밀도에 따라 미세원심분리 튜브에 분취합니다. 콜라겐 용액을 섭씨 4도에서 보관하고 10분마다 현미경으로 섬유 형성을 확인하여 중합을 모니터링합니다.
미세 원심분리기 튜브를 300G에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고 튜브에서 상층액을 버립니다. 오가노이드 펠릿을 얼음으로 옮기고 각 미세 원심분리기 튜브에 적절한 양의 콜라겐을 추가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫을 넣어 콜라겐의 오가노이드를 재현탁하고 거품이 생기지 않도록 주의합니다.
콜라겐 부유 오가노이드를 도금 표면에 천천히 조심스럽게 피펫팅합니다. 종간 조직 구성 유사성을 연구하기 위해 기저 세포외 기질 또는 콜라겐에 내장된 오가노이드의 면역형광 이미지를 얻었습니다. 콜라겐 매트릭스에 내장된 오가노이드는 침습 분석에 사용할 수 있으며, 막 토마토 라벨링 또는 액틴의 팔로이딘 염색을 통해 오가노이드 자체에서 분기되는 덩굴손의 확장을 추적하여 분석할 수 있습니다.
마지막으로, 파라핀이 포매된 오가노이드의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 오가노이드가 유방암과 동일한 조직학을 유지한다는 것을 보여줍니다. 조기 중합을 피하기 위해 겔화 돔을 피펫팅하는 동안 BECM과 콜라겐을 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 또한 PFA에서 돔을 장기간 고정하면 면역 형광 염색을 수행하는 경우 겔화 용액이 생성됩니다.
오가노이드는 또한 약물 스크리닝 및 전이의 마우스 모델과 같은 시험관 내 및 생체 내 절차에서 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 종양 조직의 치료 민감도, 전이 특성 및 면역 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
