Este protocolo se puede utilizar para investigar numerosos estudios de cultivo y proporcionar una nueva herramienta para investigar la comunicación celular directa. Este nuevo dispositivo ahorra mucho tiempo en el establecimiento de un modelo de cultivo y es aplicable a diferentes tipos de células que requieren un recubrimiento específico o no. De hecho, los cuatro compartimentos de los insertos impresos en 3D permiten cultivar diferentes tipos de células en monocapa o en 3D de la misma manera con diferentes combinaciones.
Los insertos impresos en 3D son más duraderos, flexibles, escalables y se pueden utilizar para diseñar modelos experimentales para el estudio de fisiopatologías, como la inmunología o la androgénesis. Para comenzar, mezcle los dos componentes, silicio alimentario y catalizador provistos en el kit en una proporción de 10:1, utilizando una espátula esterilizada con etanol al 70% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aplique los insertos sobre la mezcla de silicona con pinzas para que la mezcla se distribuya homogéneamente en el borde inferior del inserto.
Coloque los insertos en los pocillos de una placa de seis pocillos y aplique una presión suave para asegurarse de que los insertos estén en estrecho contacto con la placa para evitar cualquier fuga del medio de cultivo celular. Coloque la placa a 37 grados centígrados para apoyar el proceso de solidificación del silicio durante una hora. Después de la solidificación, esterilice las placas con los insertos sumergiéndolas en un baño de etanol al 70% durante 30 minutos a una hora.
A continuación, deseche el alcohol mediante pipeteo y deje que la placa se seque durante la noche en una campana de cultivo celular. Para cultivar los queratinocitos de la vaina externa de la raíz y las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, deseche el medio de los matraces y agregue cinco mililitros de tripsina para separar las células. Colocar el matraz que contiene los queratinocitos de la vaina externa de la raíz a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante cinco minutos, e incubar el matraz que contiene las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas durante cinco minutos a temperatura ambiente.
En un tubo cónico estéril de 15 mililitros, mezclar la solución de tripsina que contiene los queratinocitos de la vaina radicular externa con cinco mililitros de medio de células madre mesenquimales suplementado con 5% de FBS y factores de crecimiento y las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas con cinco mililitros de medio de células endoteliales suplementado con 5% de FBS y factores de crecimiento. Centrifugar los queratinocitos de la vaina radicular externa y las suspensiones de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en dos mililitros de sus respectivos medios.
Mezcle 10 microlitros de la suspensión celular con 10 microlitros de tinte azul de tripán y agregue 10 microlitros de la mezcla en la cámara del portaobjetos de conteo. Inserte el portaobjetos de conteo en el sistema de conteo de celdas y detecte el número de celdas y la viabilidad. Después de preparar la suspensión celular a una concentración de 50.000 células por mililitro en el medio respectivo, distribuya 800 microlitros a un mililitro de la suspensión celular en los compartimentos grandes individuales, y de 100 a 150 microlitros en los compartimentos pequeños individuales con una pipeta.
Vea los queratinocitos en medio de células madre mesenquimales suplementadas con 5% de FBS y factores de crecimiento y células endoteliales microvasculares dérmicas humanas en medio de células endoteliales, suplementadas con 5% de FBS y factores de crecimiento en los compartimentos pequeños y otros grandes. Coloque la placa de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono, o en las condiciones habituales, para permitir la adhesión y/o maduración celular. Vacíe los medios de cultivo de los diferentes compartimentos de los insertos con una pipeta.
A continuación, enjuague las células con un mililitro de PBS tibio a 37 grados centígrados en los compartimentos grandes y 200 microlitros en los compartimentos pequeños. Agregue tres mililitros de un medio común seleccionado para ser compatible con todos los tipos de células. Colocar la placa que contiene los cocultivos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas.
Separe las células con tripsina para el recuento de suspensiones celulares y verifique la viabilidad con tinción con azul de tripano. Después de observar la morfología, cuente el número de células de los diferentes compartimentos durante el experimento bajo un microscopio óptico después de 24 a 48 horas de incubación. Primero, retire los insertos de la placa de seis pocillos al final del experimento con un ligero giro y luego retire el silicio de los insertos tirando de él.
Lave los insertos con detergentes convencionales para cultivos celulares y materiales de limpieza. A continuación, esterilice los insertos para su uso futuro en un autoclave, o sumergiéndolos en un baño de etanol al 70% durante una hora. Se comparó el fenotipo y la viabilidad celular, donde se observó un 90% de viabilidad en los pocillos de las seis placas de pocillos, y un 91% en los insertos impresos en 3D para queratinocitos de la vaina radicular externa.
La viabilidad de las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas fue del 85% en los pocillos de la placa de seis pocillos, mientras que del 86% en los insertos impresos en 3D. Las comunicaciones celulares indirectas entre los queratinocitos y las células endoteliales en los insertos impresos en 3D demostraron que, en presencia de queratinocitos en los insertos, la proliferación de las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas aumentó significativamente 1,5 veces después de 24 horas, y 3,1 veces después de 48 horas en comparación con el control. Sin embargo, se demostró que el queratinocito del medio de condición de la vaina radicular externa aumenta significativamente la proliferación de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas en 1,5 veces después de 24 horas y en 2,1 veces después de 48 horas.
Se probó el modelo de cocultivo de insertos impresos en 3D para determinar el efecto de los queratinocitos en la migración de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. En la condición de control, las células endoteliales migraron y cubrieron aproximadamente el 44% del área de la herida después de 24 horas. En presencia de queratinocitos, se observó un aumento significativo en la migración de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, lo que muestra que el 43%, 67% y 99% del área de la herida se cubrió después de tres, 12 y 24 horas respectivamente.
Del mismo modo, la migración de HDMECs aumenta en presencia de queratinocitos del medio de condición de la vaina radicular externa. Es crucial asegurar el sellado del inserto a la placa, para evitar la fuga del medio de las células de un compartimento a otro. Se podrían realizar varias aplicaciones, como ensayos de proliferación, migración, formación de sedantes, análisis de ADN, ARN, proteínas y otros.
