Este protocolo demuestra una placa de cultivo celular de microtextura diseñada para el crecimiento de cientos de organoides con conocimiento del material y totalmente compatible con la microscopía. Nuestra técnica permite generar eficientemente miles de organoides, totalmente compatibles con imágenes a largo plazo y cultivos celulares a largo plazo. Este protocolo es de gran interés para aplicaciones biomédicas, como la tubería de detección de medicamentos y los dominios de investigación del cáncer.
La técnica presentada en este protocolo es fácil de dominar después de algunos intentos por parte de cualquiera que tenga experiencia con procedimientos de laboratorio y microscopía óptica. Para comenzar, corte pequeñas porciones del molde PDMS a la dimensión requerida para el dispositivo final. Córtelos paralelos a las direcciones XY de la matriz.
Coloque uno de los dados de molde PDMS preparados boca abajo en la sección plana de PDMS. Luego, usando una pipeta, agregue aproximadamente 0.1 a 0.2 mililitros de adhesivo curable UV a un lado del molde. Siga la progresión del líquido dentro de la cavidad utilizando un microscopio óptico invertido con un aumento de 10X.
Exponga el adhesivo a la luz UV para curarlo. Ajuste el tiempo de exposición dependiendo de la densidad de potencia de la fuente UV como se describe en el texto manuscrito. Usando la cantidad excesiva de adhesivo en un borde, sostenga el adhesivo curado sobre el sustrato plano de PDMS presionándolo suavemente con un dedo.
Mientras tanto, usando pinzas, pellizque una esquina del molde junto al mismo borde que se mantiene presionado y despegue lentamente el molde, mientras se asegura de que la película texturizada no se levante. Recorte el exceso de adhesivo y sustrato PDMS con una cuchilla de afeitar para dejar la capa curada, texturizada y adhesiva plana sobre el PDMS con el exceso de sustrato en un solo borde. Trate un cubreobjetos limpios con un breve proceso de plasma de oxígeno para mejorar su hidrofilicidad.
Después de la activación por plasma, espín cubra la capa delgada de adhesivo curable UV colocando el cubreobjetos en el mandril de vacío de un recubridor de centrifugado estándar y vertiendo una pequeña gota de adhesivo en el centro del cubreobjetos. Ejecute el proceso de recubrimiento por centrifugado como se describe en el texto manuscrito. Si el recubrimiento de centrifugado no está disponible, deje caer aproximadamente 0,1 mililitros de adhesivo curable UV en un cubreobjetos limpio con una pipeta.
Tome un segundo cubreobjetos y colóquelo encima del primero para que el adhesivo líquido se extienda uniformemente entre los dos cubreobjetos. Una vez que el adhesivo haya alcanzado el borde de los cubreobjetos, sepárelos suavemente deslizándolos uno sobre el otro. Una vez separados, ambos cubreobjetos estarán completamente recubiertos con una fina capa de adhesivo líquido.
Después del recubrimiento por centrifugado, precurar el adhesivo mediante la exposición a los rayos UV. Ajuste el tiempo de exposición en función de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada. Tome una de las películas texturizadas y colóquela en contacto con el cubrecubierto con adhesivo. Asegúrese de que el contacto entre el adhesivo parcialmente curado y la película texturizada sea lo más uniforme posible.
En esta etapa, el adhesivo en el cubreobjetos debe ser lo suficientemente sólido como para evitar el reflujo y el contacto se puede optimizar presionando suavemente el cubreobjetos. Exponga los cubreobjetos a la luz UV hasta que la capa adhesiva recubierta esté completamente curada. Esto sellará la película texturizada en el cubreobjetos y proporcionará un aislamiento a prueba de fugas entre las cavidades perimetrales.
Luego, con unas pinzas, pellizque el PDMS en el borde donde quedó el exceso de material después de recortar y retire el sustrato plano del PDMS. Este paso permite que la capa de película texturizada se adhiera al cubreobjetos con acceso abierto en la parte superior para la siembra de celdas. Antes de la siembra celular, en un dispositivo pasivado con copolímero biométrico como se describe en el manuscrito, dispensar un mililitro de PBS estéril en las placas de Petri de cultivo celular de 35 milímetros.
Desgasifique el plato con PBS estéril utilizando la cámara de vacío durante 10 minutos, seguido de varias rondas de pipeteo para eliminar todas las burbujas. Reemplace el PBS con medio de cultivo estéril y esterilice la placa con luz UV durante 30 minutos bajo una campana de cultivo celular. Prepare una suspensión celular siguiendo las recomendaciones de preparación de tripsinización o suspensión celular para las células de interés como se describe en el texto manuscrito.
Contar y ajustar la concentración celular a 500, 000 células por mililitro en el medio de cultivo celular recomendado. Retire el tampón PBS de la placa de cultivo celular de 35 milímetros y luego dispense un mililitro de la suspensión celular ajustada. Coloque la placa de cultivo celular de nuevo en la incubadora de células durante 10 minutos.
Aproximadamente de 80 a 100 células entrarán en cada cavidad perimetral. Después de aproximadamente 10 minutos de incubación, recupere la placa de cultivo celular de la incubadora y aspire suavemente la suspensión celular para eliminar las células no atrapadas. Agregue un mililitro de medio de cultivo a la placa de cultivo y colóquelo nuevamente en la incubadora celular.
Opcionalmente, para recuperar los organoides después de que crezcan en los pozos, pellizque la capa adhesiva texturizada en el borde cortado con pinzas y despéguela suavemente del cubreobjetos de vidrio, pero manténgala sumergida en el medio. El aumento de la concentración de copolímero biométrico aumentó el espesor del recubrimiento. La desgasificación completa de las placas de cultivo celular fue esencial para eliminar las burbujas de aire atrapadas en las cavidades perimetrales.
Los organoides se formaron después de los días dos y 15 de cultivo. La microscopía confocal del disco giratorio mostró imágenes representativas de los organoides y una reconstrucción 3D. Al preparar el plato de cultivo, es importante prestar atención al ensamblaje del molde o la pila de sustratos y garantizar un buen contacto entre la película texturizada y el cubreobjetos.
La contención proporcionada por nuestras microcavidades y la ausencia de pérdida de material ha atraído la atención de los investigadores de biología espacial interesados en estudiar el efecto de la microgravedad en la homeostasis de los organoides.
