Este método, un protocolo de transformación reproducible para Schrenkiella parvula, puede ayudar a responder preguntas en el campo de la generación comparativa y funcional de plantas, especialmente estudios que investigan adaptaciones de plantas a entornos hostiles. Esta técnica permite realizar investigaciones de funciones rutinarias en Schrenkiella parvula en el extremofito adaptado a las tensiones salinas multiiónicas. También permite estudios comparativos que también miran a su pariente cercano, el padre madre Aribidopsis Thaliana.
La comparación de Schrenkiella Parvula con Aribidopsis Thaliana puede proporcionar información sobre las varianzas en la regulación y función genética que permiten la adaptación única de Schrenkiella parvula. El protocolo de transformación de Arabidopsis Thaliana ya está bien establecido. El método ahora permite estudios comparativos utilizando plantas transgénicas de Schrenkiella Parvula.
Generalmente los investigadores nuevos en este método lucharán debido al hábito de floración y la morfología de las hojas de las plantas de Schrenkiella Parvula que dificultan la transformación efectiva utilizando una inmersión de flora, así como la selección de verdaderos transformadores. Para comenzar, utilice un palillo de dientes húmedo para transferir alrededor de 20 a 25 semillas de S.Parvula a suelo húmedo. Luego estratifica las semillas a cuatro grados centígrados durante cinco a siete días.
Después de la estratificación, devolver las semillas a la cámara de crecimiento durante siete a 10 días. Una vez que todas las plántulas han germinado, deje sólo una plántula en cada una de las cuatro esquinas y en el centro de las ollas. Cultivar las plantas durante ocho a 10 semanas en la cámara de crecimiento hasta que floreen.
El día de la transformación, seleccione S.Parvula plants según el protocolo de texto. Utilice fórceps y tijeras pequeñas para eliminar las inflorescencias polinizadas que ya se están convirtindo en silicosas. Después de que las plantas estén listas, prepare una solución de infiltración de agrobacterio.
Después de esto, sumergir la inflorescencia S.Parvula en solución de infiltración de agrobacterium durante 20 segundos. Aquí se muestra la etapa más temprana de las plantas que se pueden utilizar para la transformación, siempre y cuando los silicos ya desarrollados se eliminen antes de la transformación, se pueden utilizar plantas más viejas con más flores. Después de la transformación, coloque las plantas sumergidas en flor horizontalmente en bandejas limpias con cúpulas para cubrir las plantas.
A continuación, coloque las plantas en una sala de crecimiento oscuro durante uno o dos días. Devolver las plantas a una posición vertical y transferirlas a la sala de crecimiento. En la semana siguiente, monitoree las inflorescencias sumergidas.
Diez días después de la primera inmersión floral, las plantas de S.Parvula seguirán produciendo nuevas inflorescencias y silicosas. Se puede realizar una segunda ronda de inmersión floral para transformar aún más las nuevas inflorescencias emergentes. Cultivar las plantas hasta que las semillas maduren, y cosechar las semillas alrededor de 21 semanas.
Seque las semillas durante dos a tres semanas a temperatura ambiente en un recipiente hermético lleno de desecantes. Plantar las semillas T one de acuerdo con el protocolo de texto. Cultivar las plantas hasta que se desarrollen las dos primeras o tres hojas verdaderas.
Para realizar la primera selección de resistencia a herbicidas, diluir el herbicida de amonio con glufosinato y rocíelo en las plántulas. Cubra las plántulas con las cúpulas durante la noche. Vuelva a colocar las bandejas en la sala de crecimiento y retire la cúpula.
Espere hasta que la mayoría de las plántulas sean seleccionadas por el herbicida. Para comenzar la segunda selección, identifique las plantas que sobreviven después de ser rociadas de tres a cuatro veces con la solución BASTA. Después de cultivar las plantas durante dos a tres semanas más, seleccione la hoja madura más grande en cada planta.
A continuación, frote suavemente la superficie de la hoja con un dedo para eliminar la capa de cera. A continuación, coloque una gota de la solución basta diluida en la hoja. Supervise las hojas tratadas con la solución basta en busca de signos de marchitamiento durante una semana.
Finalmente seleccione las plantas con hojas no afectadas por las gotas BASTA para su posterior análisis. En este protocolo, S.Parvula se transformó con agrobacterium utilizando un método de inmersión floral. La infección por agrobacterium dio lugar al aborto de algunas flores.
Sin embargo, las plantas de S.Parvula continuaron produciendo nuevas flores después de la primera inmersión de flores, y podrían transformarse de nuevo. Usando las pruebas de pulverización y caída basta, los verdaderos transformadores positivos pueden ser identificados con precisión. El número de muestras analizadas mediante la confirmación de PCR se puede reducir.
Si bien este método es similar a la transformación de Arabidopsis Thaliana, es importante recordar las diferencias en el crecimiento y la morfología de Schrenkiella Parvula. Modificar el protocolo para reflejar estas diferencias es fundamental para una transformación correcta. Esta técnica podría ayudar a los investigadores a explorar la evolución de las variaciones genómicas que conducen a múltiples adaptaciones de estrés salino en el modelo de extremofito, Schrenkiella Parvula.
Combinando esta técnica con la información sobre las funciones de Aradopsis Thaliana, otra planta estrechamente relacionada con Schrenkiella Parvula. Los investigadores pueden estudiar las variaciones en la regulación y las funciones que estas son dos estructuras distintas entre estas dos especies. Durante el proceso de transformación, es importante contener toda la solución de infiltración de agrobacterium en recipientes autoclavebles.
Esterilice y deseche de forma segura todos los materiales que entraron en contacto con agrobacterium, incluidos guantes, puntas de pipeta macro y toallas de papel.
