Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Ojo (NEI), el fondo R01 EY029751-04 del Instituto Nacional del Ojo (NEI). Nos gustaría agradecer a la Dra. Sylvia B. Smith, ya que este protocolo fue una versión modificada basada en su protocolo de aislamiento celular de Müller.

Todos los experimentos con animales se ajustaron a la declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y se realizaron siguiendo nuestro protocolo animal aprobado por el Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y las políticas de la Universidad de Oakland (número de protocolo 2022-1160)
1. Preparación de medios y soluciones
<ol><li>Prepare la solución oftálmica de células de Müller complementando el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, detalles en la tabla de materiales) con penicilina/estreptomicina en la dilución 1:1000. Por ejemplo, para 10 ml de DMEM, agregue 10 μl de penicilina/estreptomicina. NOTA: Este es un medio simple sin suero preparado. Además, caliente el medio completo en un baño de agua a 37 °C antes de utilizarlo para el trabajo de cultivo celular.</li>
	<li>Prepare medios completos de crecimiento de células primarias de Müller complementando DMEM con un 10% de suero fetal bovino (FBS, inactivado por calor) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Por ejemplo (500 mL de medio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Prepare una solución de tripsina-EDTA al 0,05% con colagenasa IV a una concentración de 200 U/mL (la tripsina-EDTA se utiliza para disolver la cantidad calculada de polvo de colagenasa IV para alcanzar la concentración necesaria).</li>
</ol>2. Enucleación
<ol><li>Sacrificar éticamente al ratón mediante la inhalación de CO2 siguiendo las directrices de la IACUC.<ol><li>Brevemente, coloque el (los) animal (s) en la cámara de CO2 para introducir 100% de CO2 a una tasa de llenado del 30-70% de la cámara vol / min con CO2 para lograr el objetivo de inconsciencia rápida dentro de 2-3 min con un sufrimiento mínimo para los ratones.</li>
		<li>Dado que los ratones están en una edad temprana (~ 10 días), realice la dislocación cervical como método secundario para garantizar una eutanasia adecuada.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%, coloque el mouse en una almohadilla inferior estéril.</li>
	<li>Extraiga los ojos colocando los brazos de las pinzas en la parte posterior del ojo, tirando suavemente del área orbital y enucleando los ojos aplicando presión con pinzas estilo 5/45 en el área orbital para causar proptosis. NOTA: Esterilice las herramientas de disección con etanol al 70% seguido de solución salina tampón de fosfato antes de la disección.</li>
	<li>Asegúrese de que el nervio óptico siga conectado al ojo enucleando el ojo lentamente. Asegúrese de tirar del nervio óptico (identificado visualmente como un cordón blanco) detrás del ojo. NOTA: Este paso no necesita realizarse bajo un microscopio y se puede realizar en un banco esterilizado.</li>
</ol>3. Tratamiento de los ojos enucleados
<ol><li>Cubra un tubo de centrífuga de 15 ml con papel de aluminio y llene el tubo con 10 ml de la solución ocular de células de Müller.</li>
	<li>Coloque los ojos disecados en el tubo de 15 ml que contiene la solución ocular de células de Müller y déjelos reposar toda la noche, o aproximadamente 18 horas, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 18 h, decantar la solución ocular y enjuagar brevemente los ojos con 2-3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) tibia (37 °C).</li>
	<li>Decantar el PBS y mover los ojos a una placa de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de solución de tripsina. (preparado en el paso 1.3). NOTA: La tripsina se utiliza en todo el ojo enucleado, actuando como un agente disociativo para facilitar la separación celular de las capas de la retina durante la disección. La retina disecada tiene muchas células, incluidas las células EPR, que son pegajosas y tienen más probabilidades de contaminar el cultivo de células de Müller14. El examen microscópico demostró claramente que después de 5 días de aislamiento (durante el primer cambio de medio), las células del EPR se desprendieron de la placa y murieron13. El medio utilizado para el aislamiento del EPR es DMEM/F-12, con una composición diferente al DMEM (utilizado en el aislamiento de células de Müller), que contiene piruvato de sodio y glucosa baja.</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora e incube durante 1,5 a 2 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Después de la incubación, transfiera los ojos a una placa de Petri de 60 mm que contenga aproximadamente 5 ml de medio de crecimiento de células primarias de Müller completas.</li>
</ol>4. Disección
NOTA: Este procedimiento debe llevarse a cabo dentro del ambiente estéril de la campana de cultivo. Por lo tanto, es esencial esterilizar a fondo las superficies de la campana con alcohol al 70%, junto con todas las herramientas y el microscopio de disección. Vale la pena señalar que el video se grabó fuera del capó para una mejor visibilidad y una demostración más clara.
<ol><li>Coloque un pequeño trozo de tejido esterilizado de laboratorio en el plato para ayudar a estabilizar los ojos durante la disección. Coloque los ojos bajo un microscopio de disección para comenzar la disección. NOTA: El uso de tejido de grado de laboratorio facilita las maniobras de los ojos en un plato lleno de líquido (medio completo), lo que garantiza una disección precisa.</li>
	<li>Use tijeras Vannas y pinzas estilo M5S para extirpar el tejido conectivo, los músculos extraoculares y el nervio óptico.<ol><li>Agarre el ojo con pinzas estilo M5S y haga una incisión en la sección de ora serrata con unas tijeras Vannas o una aguja de jeringa. NOTA: Hay una línea circular de color azul claro entre la parte anterior y posterior del ojo llamada ora serrata, que se puede usar como punto de referencia para una dirección precisa durante la disección.</li>
		<li>Sujete la incisión con pinzas estilo M5S y tire o desgarre la córnea de la parte posterior del ojo. Tire en pequeños incrementos para garantizar que la integridad de la retina permanezca intacta. NOTA: Estos pasos consisten en extirpar la parte anterior del ojo (córnea, iris y cristalino) de la parte posterior de la copa del ojo (retinas neurales y pigmentadas).</li>
		<li>Para mantener la integridad de las capas de la retina, tire suavemente y retire el epitelio pigmentado de la retina neural. La retina neural debe estar libre de manchas negras para garantizar la pureza del aislamiento tanto como sea posible, ya que la capa de EPR suele ser pegajosa y adherida a la retina neuronal.</li>
		<li>Corta la retina neural diseccionada en trozos pequeños antes de recogerla en una placa para asegurar una distribución homogénea de las células en la placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque las retinas neurales en un matraz T25 que contenga 4 ml de medio de crecimiento primario completo de células de Müller.</li>
	<li>Por último, coloque el matraz en una incubadora e incube a 37 °C y 5% deCO2.</li>
</ol>5. Cultivo de células gliales primarias de Müller
<ol><li>No mueva el matraz durante 3-5 días para promover el crecimiento celular.</li>
	<li>Cambie el medio después del quinto día y cada dos días a partir de entonces hasta que las células estén confluentes en un 90%.</li>
</ol>6. Pasaje de células gliales primarias de Müller
<ol><li>Aspire el medio de cultivo celular de Müller, seguido de 2 mL de lavado en PBS, y aspire fuera el PBS. Agregue 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (1x), o lo suficiente para cubrir la placa.</li>
	<li>Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Asegúrese de que las células se separen de la placa bajo el microscopio. A continuación, recoja la suspensión celular y añada 4 ml de medios de crecimiento de células primarias de Müller precalentados (37 °C) (preparados en el paso 1.2) al tubo de recogida.</li>
	<li>Centrífuga durante 7 min a 300 x g. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de crecimiento de células primarias de Müller completo. Debido a que el número de células puede variar según la cantidad de ojos disecados, por lo tanto, es mejor contar las células antes de la siembra y la incubación. La densidad de siembra recomendada es de 3,0 x 106 celdas en un matraz T75. NOTA: Las celdas se pueden pasar hasta 4-5 veces. Sin embargo, los resultados más consistentes del experimento se encuentran después de 1-2 pasajes.</li>
</ol>7. Inmunofluorescencia
NOTA: Utilice el protocolo de inmunofluorescencia para teñir y validar la especificidad de las células de Müller. A continuación, se ofrece una breve descripción del protocolo de inmunofluorescencia. Este paso se realiza después del primer paso12.
<ol><li>Siembre las células en un portaobjetos de cámara de cultivo celular (30.000 células por pocillo para un portaobjetos de cámara de 8 pocillos).</li>
	<li>Cultivar las células aisladas durante 24-48 h en un medio de cultivo celular Müller completo (preparado en el paso 1.2) a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire el medio y lave el portaobjetos de la cámara con 250-300 μL de 1x PBS en cada pocillo cuando las celdas tengan un 80-90% de confluente.</li>
	<li>Fije el portaobjetos durante 10 a 15 minutos en 250-300 μL de paraformaldehído al 4% en cada pocillo, seguido de un lavado con PBS/TX-100 (5 min cada uno/3x).</li>
	<li>Añadir tampón de bloqueo durante 1 h a 37 °C (ver tabla de materiales).</li>
	<li>Aspire la solución de bloqueo, luego agregue los anticuerpos primarios específicos para las células de Müller para confirmar la pureza de las células aisladas usando glutamina sintetasa y vimentina 5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando una concentración de anticuerpos de 1:100-1:200 en tampón de bloqueo en un volumen de 150-200 μL/portaobjetos). Lave el portaobjetos con lavados PBS/TX-100 (5 y 10 min cada uno). NOTA: Se eligieron estos anticuerpos porque son características distintivas para identificar las células de Müller y garantizar el éxito y la pureza del cultivo de células de Müller.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo secundario (con una concentración de anticuerpos que oscila entre 1:1000 en tampón de bloqueo en un portaobjetos de 150-200 μL) e incubar durante 1 h a 37 °C. A continuación, lavar con PBS/Triton X-100, tres veces (5-10 min cada una).</li>
	<li>Aplique una gota de medio de montaje DAPI para etiquetar los núcleos antes de cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos. Evite las burbujas de aire al colocar el cubreobjetos.</li>
	<li>Use un microscopio fluorescente para revisar el portaobjetos y capturar imágenes (ver Tabla de Materiales). NOTA: Las celdas se ubican con DAPI a ex/em 359/461 con un aumento de 10x para ubicar las celdas; Un aumento mayor puede capturar células. Otras longitudes de onda dependerían del color elegido. Color verde (GFP)- ex/em 488/510. Color rojo (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar que sean relevantes para el contenido de este artículo.

El aislamiento del epitelio pigmentado primario de la retina (EPR) de ratones fue documentado previamente por nuestro laboratorio. Este manuscrito describe un protocolo de demostración detallado para el aislamiento primario de células de Müller. Este procedimiento implica la enucleación, el tratamiento, la disección, la recolección, la siembra, el cultivo y la caracterización de células de Müller aisladas de ojos de ratón. Se basa en un protocolo exitoso que se encontró en publicaciones anteriores y en nuestro...

Las células de Müller (MC) son las principales y más abundantes células gliales que se encuentran en el tejido de la retina. Son los actores clave en el suministro de integridad estructural y funciones metabólicas dentro de la retina1. La estructura estratégica de los MC se extiende por todo el grosor de la retina, proporcionando así soporte a la retina. Además de sus propiedades de andamio, tienen funciones metabólicas para las neuronas de la retina, suministrándoles sustratos energéticos, como la glucosa y el lactato. Estas funciones son cruciales para mantener una función neuronal saludable. Se ha descrito que el deterioro de las MC contribuye a diversas enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética y el glaucoma 2,3. Las MC pueden ser fuentes celulares endógenas para la terapia regenerativa en la retina1. También comprenden una porción significativa de la retina, y una fuerte evidencia sugiere que en varias especies, estas células pueden ser estimuladas para reemplazar lasneuronas faltantes. Colaboran de manera beneficiosa con las neuronas, y los extremos de las células de Müller que se ramifican cónicamente desenvainan densamente los vasos sanguíneos y conectan los componentes neuronales de la retina. Con el fin de mantener el desarrollo neuronal y la plasticidad neuronal, las células de Müller actúan como un sustrato blando para las neuronas, protegiéndolas de los traumatismosmecánicos. Además, en circunstancias patológicas, las células de Müller pueden diferenciarse en progenitores neurales o células madre que replican o regeneran los fotorreceptores y neuronas perdidos 2,3,4. Las células de Müller conservan las características de las células madre de la retina, incluyendo diferentes niveles de potencial de autorrenovación y diferenciación 5,6. La célula glial de Müller tiene un linaje retiniano significativo que produce factores neurotróficos, absorbe y recicla neurotransmisores, amortigua espacialmente los iones y mantiene la barrera hematorretiniana para mantener la retina en homeostasis 7,8,9. Esto pone de manifiesto el potencial de las células de Müller como una herramienta prometedora en las terapias basadas en células para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina. Las células de Müller son la glía principal distribuida por toda la retina, conectándose tanto con las neuronas como con los vasos sanguíneos. Desempeñan un papel protector crucial, proporcionando un soporte estructural y metabólico esencial para mantener la viabilidad y la estabilidad de las células de la retina. Desafortunadamente, se encuentran muy pocos protocolos en la literatura para el aislamiento primario de células de Müller de la retina10,11.
Presentamos un enfoque mejorado para aislar y cultivar de forma fiable células primarias de Müller de ratón. Este protocolo se utilizó en nuestro grupo para aislar células de Müller de ratones salvajes C57BL/6 y ratones transgénicos12,13. Para este protocolo se utilizan ratones de entre 5 y 11 días de edad, sin preferencia de sexo. Las celdas han sido pasadas hasta 4 veces; sin embargo, en P4 dejan de adherirse al matraz y se hace difícil cultivar un cultivo saludable. El cultivo a menudo está contaminado con células epiteliales pigmentadas de la retina (EPR), por lo que las células deben pasar al menos una vez antes de realizar cualquier experimento adicional en la línea celular. El paso permite un mayor aislamiento de los contaminantes. Por lo tanto, el protocolo presentado ofrece una forma rápida y eficaz de aislar células de Müller de ratón, que luego pueden utilizarse como una plataforma fiable para investigar dianas terapéuticas y evaluar posibles tratamientos para las enfermedades de la retina14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

La principal célula de soporte de la retina es la célula glial de Müller de la retina. Cubren toda la superficie de la retina y están muy cerca tanto de los vasos sanguíneos de la retina como de las neuronas de la retina. Debido a su crecimiento, las células de Müller realizan varias tareas cruciales en una retina sana, incluida la absorción y el reciclaje de neurotransmisores, compuestos de ácido retinoico e iones (como el potasio K+). Además de regular el flujo sanguíneo y mantener la barrera hematorretiniana, también regulan el metabolismo y el suministro de nutrientes a la retina. En este manuscrito se presenta un procedimiento establecido para aislar células primarias de ratón Müller. Para comprender mejor los procesos moleculares subyacentes implicados en los diversos modelos de ratón de trastornos oculares, el aislamiento celular de Müller es un enfoque excelente. Este manuscrito describe un procedimiento detallado para el aislamiento de células de Müller de ratones. Desde la enucleación hasta la siembra, todo el proceso dura unas pocas horas. Durante 5-7 días después de la siembra, no se debe cambiar el medio para permitir que las células aisladas crezcan sin obstáculos. La caracterización celular mediante morfología y distintos marcadores inmunofluorescentes es la siguiente en el proceso. Los pasos máximos para las celdas son de 3 a 4 veces.

Validación de la especificidad, pureza y función de barrera de células Müller aisladas Para confirmar la viabilidad, la morfología y las cualidades distintivas de las células de Müller aisladas, las células se examinaron bajo un microscopio óptico. Se registraron las imágenes P0 y P1 (Figura 1A). Para comprobar la contaminación de las células de Müller aisladas con células EPR y confirmar su pureza, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) utiliz...

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.1K vistas.  Oakland University. Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Video: Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Investigación

Biología

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Aislamiento, caracterización y alto rendimiento análisis de flujo extracelular de ratón células epiteliales tubulares renales primarias

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...