この研究は、国立眼病研究所(NEI)、国立眼病研究所(NEI)基金R01 EY029751-04の支援を受けました。Sylvia B. Smith博士は、このプロトコルがMüller細胞単離のプロトコルに基づいて修正されたバージョンであるため、感謝の意を表します。

動物を用いたすべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠し、Institute for Animal Care and Use Committee(IACUC)およびオークランド大学のポリシー(プロトコル番号2022-1160)によって承認された動物プロトコルに従って行われました。
1. 培地と溶液の調製
<ol><li>Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM、材料表の詳細)にペニシリン/ストレプトマイシンを1:1000の希釈で添加することにより、Müller細胞眼液を調製します。例えば、10 mLのDMEMには、10 μLのペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。 注:これは調製されたシンプルな無血清培地です。また、細胞培養作業に使用する前に、培地全体を37°Cのウォーターバスで温めてください。</li>
	<li>DMEMに10%ウシ胎児血清(FBS、熱不活化)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより、完全な初代ミュラー細胞増殖培地を調製します。たとえば、(500 mLのDMEM培地+ 50 mLのFBS+ 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン)。.</li>
	<li>0.05% トリプシン-EDTA溶液をコラゲナーゼIVと200 U/mLの濃度で調製します(トリプシン-EDTAを使用して、計算された量のコラゲナーゼIV粉末を溶解し、必要な濃度に到達します)。</li>
</ol>2. エヌクリーション
<ol><li>IACUCガイドラインに従ってCO2 吸入を使用してマウスを倫理的に安楽死させます。<ol><li>簡単に言えば、動物をCO2チャンバーに入れて、チャンバーvol / minの30〜70%の充填率で100%のCO2を導入し、マウスへの苦痛を最小限に抑えて2〜3分以内に意識を急速に失うという目標を達成する。</li>
		<li>マウスは若い年齢(~10日)であるため、適切な安楽死を確保するための二次的な方法として子宮頸部脱臼を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>作業領域を70%エタノールで滅菌した後、マウスを滅菌アンダーパッドに置きます。</li>
	<li>ピンセットの腕を目の後ろに置き、眼窩領域からそっと引っ張って眼窩領域から引き抜き、眼窩領域に5/45スタイルのピンセットで圧力を加えて眼球を摘出して眼球を伸ばします。 注:解剖前に、解剖ツールを70%エタノールで滅菌し、続いてリン酸緩衝生理食塩水で滅菌します。</li>
	<li>視神経がまだ目に接続されていることを確認し、眼球をゆっくりと摘出します。視神経(白いコードとして視覚的に識別される)を目の後ろに引っ張るようにしてください。 注:この手順は顕微鏡下で実行する必要はなく、滅菌されたベンチで実行できます。</li>
</ol>3.除核眼の治療
<ol><li>15 mLの遠心分離チューブをアルミホイルで覆い、チューブに10 mLのミュラー細胞眼液を入れます。</li>
	<li>解剖した眼球をミュラー細胞眼液が入った15mLチューブに入れ、室温で一晩または約18時間放置します。</li>
	<li>18時間後、眼液をデカンタし、2〜3 mLの温めた(37°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で眼を短時間すすいでください。</li>
	<li>PBSをデカントし、10mLのトリプシン溶液が入った100mmのシャーレに目を移します。(ステップ1.3で準備)。 注:トリプシンは除核眼全体に使用され、解剖中の網膜層からの細胞分離を促進する解離剤として機能します。解剖された網膜には、RPE細胞を含む多くの細胞があり、これらは粘着性があり、ミュラー細胞培養を汚染する可能性が最も高い14。顕微鏡検査では、5日間の単離後(最初の培地交換中)に、RPE細胞がプレートから剥離して13個死んだことが明確に示されました。RPE単離に使用される培地はDMEM/F-12で、DMEM(ミュラー細胞単離に使用)とは異なる組成で、ピルビン酸ナトリウムと低グルコースが含まれています。</li>
	<li>ディッシュをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO2で1.5〜2時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベート後、約5 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地が入った60 mmのシャーレに眼球を移します。</li>
</ol>4. 解剖
注:この手順は、培養フードの無菌環境内で実行する必要があります。したがって、フードの表面を70%アルコールで徹底的に滅菌し、すべてのツールと解剖顕微鏡を滅菌することが不可欠です。ビデオは、視認性を高め、デモンストレーションの目的でボンネットの外で録画されたことは注目に値します。
<ol><li>滅菌したラボグレードの組織の小片を皿に入れて、解剖中の目を安定させます。解剖顕微鏡の下に目を置き、解剖を開始します。 注:ラボグレードの組織を使用すると、液体で満たされた皿(完全なメディア)での目の操作が容易になり、正確な解剖が保証されます。</li>
	<li>バンナスのハサミとM5Sスタイルのピンセットを使用して、結合組織、外眼筋、視神経を切除します。<ol><li>M5Sスタイルのピンセットで目をつかみ、バンナスのハサミまたは注射器の針でオラセラータセクションを切開します。 注:眼の前部と後部の間には、ora serrataと呼ばれる水色の円形の線があり、解剖中の正確な方向の目印として使用できます。</li>
		<li>M5Sスタイルのピンセットで切開部をつかみ、目の後部から角膜を引っ張るか引き裂きます。網膜の完全性が損なわれないように、少しずつ引っ張ります。 注:これらの手順は、アイカップの後部(神経および色素性網膜)から目の前部(角膜、虹彩、およびレンズ)を取り除くためのものです。</li>
		<li>網膜層の完全性を維持するために、神経網膜から網膜色素上皮をそっと引っ張って取り除きます。RPE層は通常粘着性があり、ニューロン網膜に付着しているため、神経網膜には、分離の純度を可能な限り確保するために、黒い斑点がないようにする必要があります。</li>
		<li>解剖した神経網膜をプレートに集める前に細かく切ってから、プレート上の細胞が均一に広がるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地を含むT25フラスコに神経網膜を播種します。</li>
	<li>最後に、フラスコをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。</li>
</ol>5. ミュラー初代グリア細胞の培養
<ol><li>細胞の成長を促進するために、フラスコを3〜5日間動かさないでください。</li>
	<li>5日目以降は培地を交換し、その後は細胞が90%コンフルエントになるまで1日おきに交換します。</li>
</ol>6. ミュラー初代グリア細胞の継代
<ol><li>Müller細胞培養培地を吸引し、続いてPBSで2 mLの洗浄を行い、PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTA(1x)を2 mL、またはプレートを覆うのに十分な量を加えます。</li>
	<li>室温で5〜10分間インキュベートします。</li>
	<li>顕微鏡下で細胞がプレートから剥離していることを確認します。次に、細胞懸濁液を回収し、予熱した4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地(ステップ1.2で調製)を回収チューブに加えます。</li>
	<li>300 x gで7分間遠心分離します。上清を吸引した後、ペレットを10 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地に再懸濁します。細胞数は解剖した眼の数によって異なる可能性があるため、播種やインキュベーションの前に細胞を数えることをお勧めします。推奨される播種密度は、T75フラスコ中の3.0 x 106 セルです。 注:細胞は最大4〜5回継代できます。ただし、最も一貫性のある実験結果は、1〜2回の継代後に見つかります。</li>
</ol>7. 免疫蛍光
注:免疫蛍光プロトコールを使用して、ミュラー細胞の特異性を染色および検証します。ここでは、免疫蛍光プロトコルの簡単な概要を示します。このステップは、第1のパッセージ12の後に行われる。
<ol><li>細胞を細胞培養チャンバースライド(8ウェルチャンバースライドでウェルあたり30,000細胞)に播種します。</li>
	<li>単離した細胞を、37°Cおよび5%CO2の完全ミュラー細胞培養培地(ステップ1.2で調製)で24〜48時間培養します。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞が80〜90%コンフルエントになったら、各ウェルに250〜300μLの1x PBSでチャンバースライドを洗浄します。</li>
	<li>スライドを各ウェル上の4%パラホルムアルデヒドの250-300μLで10〜15分間固定し、続いてPBS/TX-100で洗浄します(各5分/3x)。</li>
	<li>ブロッキングバッファーを37°Cで1時間加えます( 材料表を参照)。</li>
	<li>ブロッキング溶液を吸引し、次にMüller細胞に特異的な一次抗体を添加して、グルタミンシンテターゼとビメンチン5,12を使用して単離された細胞の純度を確認します。37°Cで3時間インキュベートします(150-200 μL/スライドの容量のブロッキングバッファー中の抗体濃度1:100-1:200を使用)。スライドをPBS / TX-100洗浄(各5分および10分)で洗浄します。 注:これらの抗体は、ミュラー細胞を同定し、ミュラー細胞培養の成功と純度を確保するための特徴であるため、選択されました。</li>
	<li>二次抗体(抗体濃度が1:1000の範囲のブロッキングバッファー、150-200 μL/スライド)を添加し、37°Cで1時間インキュベートします。 その後、PBS/Triton X-100で3回(各5〜10分)洗浄します。</li>
	<li>DAPI封入剤を一滴塗布して核を標識し、スライドをカバースリップで覆います。カバースリップを置くときは気泡を避けてください。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、画像を撮影します( 資料の表を参照)。 注:セルは、細胞を見つけるために10倍の倍率でex / em 359/461のDAPIで配置されます。倍率が高いほど細胞を捕捉できます。他の波長は、選択した色によって異なります。緑色(GFP)-ex/em 488/510。赤色(Cy3) - ex/em 555/569。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

著者は、この記事の内容に関連することを宣言する利益相反はありません。

マウスからの一次網膜色素上皮(RPE)の単離は、以前に私たちの研究室によって文書化されました。この原稿では、Müller初代細胞単離の詳細なデモンストレーションプロトコルについて説明します。この手順には、マウスの眼から単離されたMüller細胞の核出術、処理、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。これは、以前の出版物で見つかった以前に成功したプロトコルと、...

ミュラー細胞(MC)は、網膜組織に見られる主要かつ最も豊富なグリア細胞です。彼らは、網膜1内の構造的完全性と代謝機能を提供する主要なプレーヤーです。MCの戦略的な構造は、網膜の厚さ全体に広がっているため、網膜をサポートします。足場のような特性に加えて、それらは網膜ニューロンの代謝機能を持ち、グルコースや乳酸などのエネルギー基質を供給します。これらの機能は、健康な神経機能を維持するために重要です。MCの障害は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障など、さまざまな網膜疾患の一因となることが報告されています2,3。MCは、網膜の再生治療のための内因性細胞源となり得る1。それらはまた、網膜のかなりの部分を占めており、強力な証拠は、いくつかの種で、これらの細胞が欠落しているニューロンを置換するために刺激され得ることを示唆している2。それらはニューロンと有益に協力し、円錐状に分岐するミュラー細胞の端足が血管を密に引き抜き、網膜の神経成分をつなぎます。ニューロンの発達とニューロンの可塑性を維持するために、ミュラー細胞はニューロンの柔らかい基質として機能し、ニューロンを機械的外傷から保護します3。さらに、病理学的状況下では、ミュラー細胞は、失われた光受容体およびニューロンを複製または再生する神経前駆細胞または幹細胞に分化することがある2,3,4。ミュラー細胞は、自己複製や分化のためのさまざまなレベルの可能性など、網膜幹細胞の特性を保持しています5,6。ミュラーグリア細胞は、神経栄養因子を産生し、神経伝達物質を取り込み、リサイクルし、イオンを空間的に緩衝し、網膜を恒常性に保つために血液網膜関門を維持する重要な網膜系統を有する7,8,9。このことは、網膜変性症に関連する疾患を治療するための細胞ベースの治療における有望なツールとしてのミュラー細胞の可能性を浮き彫りにしています。ミュラー細胞は、網膜全体に分布する主要なグリアであり、ニューロンと血管の両方につながっています。それらは重要な保護的役割を果たし、網膜細胞の生存率と安定性を維持するために不可欠な構造的および代謝的サポートを提供します。残念ながら、網膜からの初代ミュラー細胞単離に関する文献には、非常に少ないプロトコルが見つかっています10,11。
私たちは、マウス初代ミュラー細胞を確実に単離し、培養するための強化されたアプローチを紹介します。このプロトコルは、野生型C57BL/6マウスおよびトランスジェニックマウス12,13からMüller細胞を単離するために、我々のグループで使用された。このプロトコルには、性別の好みがない5〜11日齢のマウスが使用されます。細胞は最大4回継代されています。しかし、P4ではフラスコに付着しなくなり、健康な培養物を育てることが難しくなります。培養物は網膜色素上皮(RPE)細胞で汚染されていることが多いため、細胞株で追加の実験を行う前に、少なくとも1回は細胞を継代する必要があります。継代により、汚染物質からのさらなる分離が可能になります。したがって、提示されたプロトコルは、マウスMüller細胞を単離するための迅速かつ効果的な方法を提供し、その後、治療標的を研究し、網膜疾患の潜在的な治療法を評価するための信頼性の高いプラットフォームとして使用することができます14。

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media to grow M&amp;uuml;ller cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>For complete Muller cell culture media</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>For complete M&amp;uuml;ller cell culture media</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23&quot; X 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

網膜の主要な支持細胞は、網膜グリアミュラー細胞です。それらは網膜表面全体を覆い、網膜血管と網膜ニューロンの両方に近接しています。ミュラー細胞は、その増殖により、神経伝達物質、レチノイン酸化合物、イオン(カリウムK+など)の取り込みとリサイクルなど、健康な網膜でいくつかの重要な役割を果たします。血流を調節し、血液網膜関門を維持することに加えて、それらはまた、網膜への代謝と栄養素の供給を調節します。この原稿では、マウスMüller初代細胞を単離するための確立された手順を紹介しています。眼疾患のさまざまなマウスモデルに関与する根底にある分子プロセスをよりよく理解するために、ミュラー細胞単離は優れたアプローチです。この原稿では、マウスからのミュラー細胞単離の詳細な手順を概説しています。除核から播種まで、全体のプロセスは約数時間続きます。播種後5〜7日間は、単離された細胞が妨げられずに成長できるように、培地を変更しないでください。次に、形態学と異なる免疫蛍光マーカーを用いた細胞の特性評価が、このプロセスの次となります。細胞の最大継代回数は3〜4倍です。

単離されたMüller細胞の特異性、純度、およびバリア機能の検証 単離されたミュラー細胞の生存率、形態、および独特の性質を確認するために、細胞を光学顕微鏡で調べました。P0およびP1の画像が記録されました(図1A)。単離されたミュラー細胞のRPE細胞によるコンタミネーションをチェックし、その純度を確認するために、RPE細胞マーカーであるRPE65に?...

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.2K ビュー.  Oakland University. この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

ビデオ: 初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

生物工学

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

生物学

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

発生生物学

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

神経科学

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

培養初代マウスRPEの特性評価と形態学的ダイナミクス

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

著者スポットライト:網膜症研究のための成体マウスからの一次網膜色素上皮細胞の効率的な単離

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

要約

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フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

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フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離