この研究は、国立眼病研究所(NEI)、国立眼病研究所(NEI)基金R01 EY029751-04の支援を受けました。Sylvia B. Smith博士は、このプロトコルがMüller細胞単離のプロトコルに基づいて修正されたバージョンであるため、感謝の意を表します。

動物を用いたすべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠し、Institute for Animal Care and Use Committee(IACUC)およびオークランド大学のポリシー(プロトコル番号2022-1160)によって承認された動物プロトコルに従って行われました。
1. 培地と溶液の調製
<ol><li>Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM、材料表の詳細)にペニシリン/ストレプトマイシンを1:1000の希釈で添加することにより、Müller細胞眼液を調製します。例えば、10 mLのDMEMには、10 μLのペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。 注:これは調製されたシンプルな無血清培地です。また、細胞培養作業に使用する前に、培地全体を37°Cのウォーターバスで温めてください。</li>
	<li>DMEMに10%ウシ胎児血清(FBS、熱不活化)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより、完全な初代ミュラー細胞増殖培地を調製します。たとえば、(500 mLのDMEM培地+ 50 mLのFBS+ 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン)。.</li>
	<li>0.05% トリプシン-EDTA溶液をコラゲナーゼIVと200 U/mLの濃度で調製します(トリプシン-EDTAを使用して、計算された量のコラゲナーゼIV粉末を溶解し、必要な濃度に到達します)。</li>
</ol>2. エヌクリーション
<ol><li>IACUCガイドラインに従ってCO2 吸入を使用してマウスを倫理的に安楽死させます。<ol><li>簡単に言えば、動物をCO2チャンバーに入れて、チャンバーvol / minの30〜70%の充填率で100%のCO2を導入し、マウスへの苦痛を最小限に抑えて2〜3分以内に意識を急速に失うという目標を達成する。</li>
		<li>マウスは若い年齢(~10日)であるため、適切な安楽死を確保するための二次的な方法として子宮頸部脱臼を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>作業領域を70%エタノールで滅菌した後、マウスを滅菌アンダーパッドに置きます。</li>
	<li>ピンセットの腕を目の後ろに置き、眼窩領域からそっと引っ張って眼窩領域から引き抜き、眼窩領域に5/45スタイルのピンセットで圧力を加えて眼球を摘出して眼球を伸ばします。 注:解剖前に、解剖ツールを70%エタノールで滅菌し、続いてリン酸緩衝生理食塩水で滅菌します。</li>
	<li>視神経がまだ目に接続されていることを確認し、眼球をゆっくりと摘出します。視神経(白いコードとして視覚的に識別される)を目の後ろに引っ張るようにしてください。 注:この手順は顕微鏡下で実行する必要はなく、滅菌されたベンチで実行できます。</li>
</ol>3.除核眼の治療
<ol><li>15 mLの遠心分離チューブをアルミホイルで覆い、チューブに10 mLのミュラー細胞眼液を入れます。</li>
	<li>解剖した眼球をミュラー細胞眼液が入った15mLチューブに入れ、室温で一晩または約18時間放置します。</li>
	<li>18時間後、眼液をデカンタし、2〜3 mLの温めた(37°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で眼を短時間すすいでください。</li>
	<li>PBSをデカントし、10mLのトリプシン溶液が入った100mmのシャーレに目を移します。(ステップ1.3で準備)。 注:トリプシンは除核眼全体に使用され、解剖中の網膜層からの細胞分離を促進する解離剤として機能します。解剖された網膜には、RPE細胞を含む多くの細胞があり、これらは粘着性があり、ミュラー細胞培養を汚染する可能性が最も高い14。顕微鏡検査では、5日間の単離後(最初の培地交換中)に、RPE細胞がプレートから剥離して13個死んだことが明確に示されました。RPE単離に使用される培地はDMEM/F-12で、DMEM(ミュラー細胞単離に使用)とは異なる組成で、ピルビン酸ナトリウムと低グルコースが含まれています。</li>
	<li>ディッシュをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO2で1.5〜2時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベート後、約5 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地が入った60 mmのシャーレに眼球を移します。</li>
</ol>4. 解剖
注:この手順は、培養フードの無菌環境内で実行する必要があります。したがって、フードの表面を70%アルコールで徹底的に滅菌し、すべてのツールと解剖顕微鏡を滅菌することが不可欠です。ビデオは、視認性を高め、デモンストレーションの目的でボンネットの外で録画されたことは注目に値します。
<ol><li>滅菌したラボグレードの組織の小片を皿に入れて、解剖中の目を安定させます。解剖顕微鏡の下に目を置き、解剖を開始します。 注:ラボグレードの組織を使用すると、液体で満たされた皿(完全なメディア)での目の操作が容易になり、正確な解剖が保証されます。</li>
	<li>バンナスのハサミとM5Sスタイルのピンセットを使用して、結合組織、外眼筋、視神経を切除します。<ol><li>M5Sスタイルのピンセットで目をつかみ、バンナスのハサミまたは注射器の針でオラセラータセクションを切開します。 注:眼の前部と後部の間には、ora serrataと呼ばれる水色の円形の線があり、解剖中の正確な方向の目印として使用できます。</li>
		<li>M5Sスタイルのピンセットで切開部をつかみ、目の後部から角膜を引っ張るか引き裂きます。網膜の完全性が損なわれないように、少しずつ引っ張ります。 注:これらの手順は、アイカップの後部(神経および色素性網膜)から目の前部(角膜、虹彩、およびレンズ)を取り除くためのものです。</li>
		<li>網膜層の完全性を維持するために、神経網膜から網膜色素上皮をそっと引っ張って取り除きます。RPE層は通常粘着性があり、ニューロン網膜に付着しているため、神経網膜には、分離の純度を可能な限り確保するために、黒い斑点がないようにする必要があります。</li>
		<li>解剖した神経網膜をプレートに集める前に細かく切ってから、プレート上の細胞が均一に広がるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地を含むT25フラスコに神経網膜を播種します。</li>
	<li>最後に、フラスコをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。</li>
</ol>5. ミュラー初代グリア細胞の培養
<ol><li>細胞の成長を促進するために、フラスコを3〜5日間動かさないでください。</li>
	<li>5日目以降は培地を交換し、その後は細胞が90%コンフルエントになるまで1日おきに交換します。</li>
</ol>6. ミュラー初代グリア細胞の継代
<ol><li>Müller細胞培養培地を吸引し、続いてPBSで2 mLの洗浄を行い、PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTA(1x)を2 mL、またはプレートを覆うのに十分な量を加えます。</li>
	<li>室温で5〜10分間インキュベートします。</li>
	<li>顕微鏡下で細胞がプレートから剥離していることを確認します。次に、細胞懸濁液を回収し、予熱した4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地(ステップ1.2で調製)を回収チューブに加えます。</li>
	<li>300 x gで7分間遠心分離します。上清を吸引した後、ペレットを10 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地に再懸濁します。細胞数は解剖した眼の数によって異なる可能性があるため、播種やインキュベーションの前に細胞を数えることをお勧めします。推奨される播種密度は、T75フラスコ中の3.0 x 106 セルです。 注:細胞は最大4〜5回継代できます。ただし、最も一貫性のある実験結果は、1〜2回の継代後に見つかります。</li>
</ol>7. 免疫蛍光
注:免疫蛍光プロトコールを使用して、ミュラー細胞の特異性を染色および検証します。ここでは、免疫蛍光プロトコルの簡単な概要を示します。このステップは、第1のパッセージ12の後に行われる。
<ol><li>細胞を細胞培養チャンバースライド(8ウェルチャンバースライドでウェルあたり30,000細胞)に播種します。</li>
	<li>単離した細胞を、37°Cおよび5%CO2の完全ミュラー細胞培養培地(ステップ1.2で調製)で24〜48時間培養します。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞が80〜90%コンフルエントになったら、各ウェルに250〜300μLの1x PBSでチャンバースライドを洗浄します。</li>
	<li>スライドを各ウェル上の4%パラホルムアルデヒドの250-300μLで10〜15分間固定し、続いてPBS/TX-100で洗浄します(各5分/3x)。</li>
	<li>ブロッキングバッファーを37°Cで1時間加えます( 材料表を参照)。</li>
	<li>ブロッキング溶液を吸引し、次にMüller細胞に特異的な一次抗体を添加して、グルタミンシンテターゼとビメンチン5,12を使用して単離された細胞の純度を確認します。37°Cで3時間インキュベートします(150-200 μL/スライドの容量のブロッキングバッファー中の抗体濃度1:100-1:200を使用)。スライドをPBS / TX-100洗浄(各5分および10分)で洗浄します。 注:これらの抗体は、ミュラー細胞を同定し、ミュラー細胞培養の成功と純度を確保するための特徴であるため、選択されました。</li>
	<li>二次抗体(抗体濃度が1:1000の範囲のブロッキングバッファー、150-200 μL/スライド)を添加し、37°Cで1時間インキュベートします。 その後、PBS/Triton X-100で3回(各5〜10分)洗浄します。</li>
	<li>DAPI封入剤を一滴塗布して核を標識し、スライドをカバースリップで覆います。カバースリップを置くときは気泡を避けてください。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、画像を撮影します( 資料の表を参照)。 注:セルは、細胞を見つけるために10倍の倍率でex / em 359/461のDAPIで配置されます。倍率が高いほど細胞を捕捉できます。他の波長は、選択した色によって異なります。緑色(GFP)-ex/em 488/510。赤色(Cy3) - ex/em 555/569。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

著者は、この記事の内容に関連することを宣言する利益相反はありません。

マウスからの一次網膜色素上皮(RPE)の単離は、以前に私たちの研究室によって文書化されました。この原稿では、Müller初代細胞単離の詳細なデモンストレーションプロトコルについて説明します。この手順には、マウスの眼から単離されたMüller細胞の核出術、処理、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。これは、以前の出版物で見つかった以前に成功したプロトコルと、...

ミュラー細胞(MC)は、網膜組織に見られる主要かつ最も豊富なグリア細胞です。彼らは、網膜1内の構造的完全性と代謝機能を提供する主要なプレーヤーです。MCの戦略的な構造は、網膜の厚さ全体に広がっているため、網膜をサポートします。足場のような特性に加えて、それらは網膜ニューロンの代謝機能を持ち、グルコースや乳酸などのエネルギー基質を供給します。これらの機能は、健康な神経機能を維持するために重要です。MCの障害は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障など、さまざまな網膜疾患の一因となることが報告されています2,3。MCは、網膜の再生治療のための内因性細胞源となり得る1。それらはまた、網膜のかなりの部分を占めており、強力な証拠は、いくつかの種で、これらの細胞が欠落しているニューロンを置換するために刺激され得ることを示唆している2。それらはニューロンと有益に協力し、円錐状に分岐するミュラー細胞の端足が血管を密に引き抜き、網膜の神経成分をつなぎます。ニューロンの発達とニューロンの可塑性を維持するために、ミュラー細胞はニューロンの柔らかい基質として機能し、ニューロンを機械的外傷から保護します3。さらに、病理学的状況下では、ミュラー細胞は、失われた光受容体およびニューロンを複製または再生する神経前駆細胞または幹細胞に分化することがある2,3,4。ミュラー細胞は、自己複製や分化のためのさまざまなレベルの可能性など、網膜幹細胞の特性を保持しています5,6。ミュラーグリア細胞は、神経栄養因子を産生し、神経伝達物質を取り込み、リサイクルし、イオンを空間的に緩衝し、網膜を恒常性に保つために血液網膜関門を維持する重要な網膜系統を有する7,8,9。このことは、網膜変性症に関連する疾患を治療するための細胞ベースの治療における有望なツールとしてのミュラー細胞の可能性を浮き彫りにしています。ミュラー細胞は、網膜全体に分布する主要なグリアであり、ニューロンと血管の両方につながっています。それらは重要な保護的役割を果たし、網膜細胞の生存率と安定性を維持するために不可欠な構造的および代謝的サポートを提供します。残念ながら、網膜からの初代ミュラー細胞単離に関する文献には、非常に少ないプロトコルが見つかっています10,11。
私たちは、マウス初代ミュラー細胞を確実に単離し、培養するための強化されたアプローチを紹介します。このプロトコルは、野生型C57BL/6マウスおよびトランスジェニックマウス12,13からMüller細胞を単離するために、我々のグループで使用された。このプロトコルには、性別の好みがない5〜11日齢のマウスが使用されます。細胞は最大4回継代されています。しかし、P4ではフラスコに付着しなくなり、健康な培養物を育てることが難しくなります。培養物は網膜色素上皮(RPE)細胞で汚染されていることが多いため、細胞株で追加の実験を行う前に、少なくとも1回は細胞を継代する必要があります。継代により、汚染物質からのさらなる分離が可能になります。したがって、提示されたプロトコルは、マウスMüller細胞を単離するための迅速かつ効果的な方法を提供し、その後、治療標的を研究し、網膜疾患の潜在的な治療法を評価するための信頼性の高いプラットフォームとして使用することができます14。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

網膜の主要な支持細胞は、網膜グリアミュラー細胞です。それらは網膜表面全体を覆い、網膜血管と網膜ニューロンの両方に近接しています。ミュラー細胞は、その増殖により、神経伝達物質、レチノイン酸化合物、イオン(カリウムK+など)の取り込みとリサイクルなど、健康な網膜でいくつかの重要な役割を果たします。血流を調節し、血液網膜関門を維持することに加えて、それらはまた、網膜への代謝と栄養素の供給を調節します。この原稿では、マウスMüller初代細胞を単離するための確立された手順を紹介しています。眼疾患のさまざまなマウスモデルに関与する根底にある分子プロセスをよりよく理解するために、ミュラー細胞単離は優れたアプローチです。この原稿では、マウスからのミュラー細胞単離の詳細な手順を概説しています。除核から播種まで、全体のプロセスは約数時間続きます。播種後5〜7日間は、単離された細胞が妨げられずに成長できるように、培地を変更しないでください。次に、形態学と異なる免疫蛍光マーカーを用いた細胞の特性評価が、このプロセスの次となります。細胞の最大継代回数は3〜4倍です。

単離されたMüller細胞の特異性、純度、およびバリア機能の検証 単離されたミュラー細胞の生存率、形態、および独特の性質を確認するために、細胞を光学顕微鏡で調べました。P0およびP1の画像が記録されました(図1A)。単離されたミュラー細胞のRPE細胞によるコンタミネーションをチェックし、その純度を確認するために、RPE細胞マーカーであるRPE65に?...

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.1K ビュー.  Oakland University. この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

ビデオ: 初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

生物学

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

原発腫瘍から免疫細胞の分離

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...