Эта работа была поддержана Национальным институтом глаза (NEI), Национальным институтом глаза (NEI) фондом R01 EY029751-04. Мы хотели бы выразить признательность доктору Сильвии Б. Смит, так как этот протокол был модифицирован на основе ее протокола выделения клеток Мюллера.

Все эксперименты на животных соответствовали заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и проводились в соответствии с нашим протоколом для животных, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и политикой Оклендского университета (протокол No 2022-1160)
1. Подготовка сред и растворов
<ol><li>Приготовьте раствор для глаз с клетками Мюллера, добавив модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM, подробности в таблице материалов) пенициллином/стрептомицином в разведении 1:1000. Например, на 10 мл DMEM добавьте 10 мкл пенициллина/стрептомицина. ПРИМЕЧАНИЕ: Это простая среда, приготовленная без сыворотки. Кроме того, нагрейте готовую среду на водяной бане при температуре 37 °C перед использованием для работы с клеточными культурами.</li>
	<li>Приготовьте полную первичную питательную среду для клеток Мюллера, добавив в DMEM 10% фетальную сыворотку крупного рогатого скота (FBS, инактивированную при нагревании) и 1% пенициллин/стрептомицин. Например (500 мл среды DMEM + 50 мл FBS + 5 мл пенициллина/стрептомицина).</li>
	<li>Приготовьте 0,05% раствор Трипсин-ЭДТА с Коллагеназой IV в концентрации 200 Ед/мл (Трипсин-ЭДТА используется для растворения рассчитанного количества порошка Коллагеназы IV для достижения необходимой концентрации).</li>
</ol>2. Энуклеация
<ol><li>Этично усыпьте мышь с помощью ингаляцииCO2 в соответствии с рекомендациями IACUC.<ol><li>Вкратце, поместите животное (животных) в камеру сСО2 , чтобы ввести 100%СО2 со скоростью заполнения 30-70% объема/мин камеры сСО2 для достижения цели быстрой потери сознания в течение 2-3 минут с минимальным дискомфортом для мышей.</li>
		<li>Поскольку мыши находятся в молодом возрасте (~10 дней), выполняйте вывих шейки матки в качестве вторичного метода, чтобы обеспечить надлежащую эвтаназию.</li>
	</ol></li>
	<li>После стерилизации рабочей зоны 70% этанолом поместите мышь на стерильную подкладку.</li>
	<li>Извлеките глаза, поместив дужки пинцета в заднюю часть глаза, осторожно потянув за орбитальную область, и энуклеируйте глаза, надавливая пинцетом в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед вскрытием стерилизуйте инструменты для вскрытия 70% этанолом с последующим добавлением фосфатного буферного раствора.</li>
	<li>Убедитесь, что зрительный нерв все еще соединен с глазом, путем медленной энуклеации глаза. Обязательно потяните зрительный нерв (визуально идентифицируемый как белый шнур) за глазом. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не обязательно должен выполняться под микроскопом, и может быть выполнен на стерилизованном столе.</li>
</ol>3. Лечение энуклеированных глаз
<ol><li>Накройте пробирку центрифуги объемом 15 мл алюминиевой фольгой и заполните пробирку 10 мл раствора для глаз клеток Мюллера.</li>
	<li>Поместите рассеченные глаза в пробирку объемом 15 мл с раствором для глаз из клеток Мюллера и оставьте их на ночь или около 18 часов при комнатной температуре.</li>
	<li>Через 18 ч сцедите глазной раствор и кратковременно промойте глаза 2-3 мл подогретого (37 °C) фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).</li>
	<li>Сцедите PBS и переместите глаза в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10 мл раствора трипсина. (подготовлено на шаге 1.3). ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин используется на всем энуклеированном глазу, действуя как диссоциативный агент для облегчения отделения клеток от слоев сетчатки во время диссекции. Вскрытая сетчатка содержит множество клеток, в том числе клетки RPE, которые являются липкими и, скорее всего, загрязняют культуру клеток Мюллера14. Микроскопическое исследование наглядно показало, что после 5 дней изоляции (при первой смене среды) клетки РПЭ отделились от пластины и погибли13 человек. Средой, используемой для выделения РПЭ, является DMEM/F-12, с составом, отличным от DMEM (используемого при выделении клеток Мюллера), содержащей пируват натрия и низкое содержание глюкозы.</li>
	<li>Поместите чашку в инкубатор и инкубируйте от 1,5 до 2 часов при 37 °C и 5% CO2.</li>
	<li>После инкубации перенесите глаза в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую примерно 5 мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера.</li>
</ol>4. Вскрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна проводиться в стерильной среде капюшона. Следовательно, важно тщательно простерилизовать поверхности вытяжки 70% спиртом, а также все инструменты и микроскоп для вскрытия. Стоит отметить, что видео было записано вне капота для лучшей видимости и более четких демонстрационных целей.
<ol><li>Положите в чашку небольшой кусочек стерилизованной лабораторной салфетки, чтобы стабилизировать глаза во время вскрытия. Поместите глаза под препарирующий микроскоп, чтобы начать вскрытие. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование лабораторной ткани облегчает маневрирование глаз в наполненной жидкостью чашке (полная среда), обеспечивая точное рассечение.</li>
	<li>Используйте ножницы Vannas и пинцет в стиле M5S, чтобы удалить соединительную ткань, экстраокулярные мышцы и зрительный нерв.<ol><li>Захватите глаз пинцетом в стиле M5S и сделайте надрез в области ora пильчатой с помощью ножниц Vannas или иглы шприца. ПРИМЕЧАНИЕ: Существует светло-голубая круговая линия между передней и задней частями глаза, называемая ora serrata, которая может быть использована в качестве ориентира для точного направления во время вскрытия.</li>
		<li>Захватите разрез пинцетом в стиле M5S и вытяните или оторвите роговицу от задней части глаза. Потяните с небольшим шагом, чтобы целостность сетчатки оставалась неповрежденной. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на удаление передней части глаза (роговицы, радужной оболочки и хрусталика) из задней части наглазника (нервная и пигментированная сетчатка).</li>
		<li>Чтобы сохранить целостность слоев сетчатки, осторожно потяните и удалите пигментный эпителий сетчатки из нервной сетчатки. Нервная сетчатка должна быть свободна от каких-либо черных пятен, чтобы обеспечить максимальную чистоту изоляции, так как слой RPE обычно липкий и прикреплен к нейрональной сетчатке.</li>
		<li>Разрежьте рассеченную нервную сетчатку на мелкие кусочки перед тем, как собрать ее в пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток на пластине.</li>
	</ol></li>
	<li>Поместите нервную сетчатку в колбу T25, содержащую 4 мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера.</li>
	<li>Наконец, поместите колбу в инкубатор и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2.</li>
</ol>5. Культивирование первичных глиальных клеток Мюллера
<ol><li>Не перемещайте колбу в течение 3-5 дней, чтобы способствовать росту клеток.</li>
	<li>Меняйте среду после пятого дня и через день после этого до тех пор, пока клетки не слияются на 90%.</li>
</ol>6. Пассирование первичных глиальных клеток Мюллера
<ol><li>Аспирируйте питательную среду для клеточных культур Мюллера, а затем 2 мл промывки в PBS и аспирируйте PBS. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА (1x) или достаточно, чтобы покрыть пластину.</li>
	<li>Выдерживать 5-10 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>Убедитесь, что клетки отделены от планшета под микроскопом. Затем соберите клеточную суспензию и добавьте в пробирку для сбора 4 мл предварительно подогретой (37 °C) полной первичной среды для выращивания клеток Мюллера (приготовленной на шаге 1.2).</li>
	<li>Центрифуга в течение 7 мин при 300 x g. После аспирации надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 10 мл полной первичной питательной среды для клеток Мюллера. Поскольку количество клеток может варьироваться в зависимости от количества рассекаемых глазков, поэтому лучше подсчитывать клетки перед посевом и инкубацией. Рекомендуемая плотность высева составляет 3,0 х 106 ячеек в колбе Т75. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно пропускать до 4-5 раз. Однако наиболее последовательные результаты эксперимента обнаруживаются после 1-2 проходов.</li>
</ol>7. Иммунофлюоресценция
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте протокол иммунофлюоресценции для окрашивания и подтверждения специфичности клеток Мюллера. Вот краткий обзор иммунофлюоресцентного протокола. Этот шаг выполняется после первого прохода12.
<ol><li>Засейте клетки в предметное стекло камеры для клеточных культур (30 000 клеток на лунку для предметного стекла с 8-луночной камерой).</li>
	<li>Культивируют выделенные клетки в течение 24-48 ч в полной среде для культивирования клеток Мюллера (приготовленной на стадии 1.2) при 37 °C и 5%CO2.</li>
	<li>Отсадите среду и промойте предметное стекло камеры 250-300 мкл 1x PBS на каждую лунку, когда ячейки сливаются на 80-90%.</li>
	<li>Зафиксируйте предметное стекло на 10-15 минут в 250-300 мкл 4% параформальдегида на каждую лунку, после чего промойте PBS/TX-100 (по 5 мин каждая/3x).</li>
	<li>Добавьте блокирующий буфер на 1 ч при 37 °C (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Аспирируйте блокирующий раствор, затем добавьте первичные антитела, специфичные для клеток Мюллера, чтобы подтвердить чистоту выделенных клеток с помощью глутаминсинтетазы и виментина 5,12. Инкубировать в течение 3 ч при 37 °C (используя концентрацию антител 1:100-1:200 в блокирующем буфере в объеме 150-200 мкл/слайд). Вымойте предметное стекло с помощью смывок PBS/TX-100 (по 5 и 10 минут). ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела были выбраны потому, что они являются отличительными признаками для идентификации клеток Мюллера и обеспечения успеха и чистоты клеточной культуры Мюллера.</li>
	<li>Добавьте вторичное антитело (с концентрацией антитела в диапазоне от 1:1000 в блокирующем буфере в концентрации 150-200 мкл/слайд) и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °С. Затем постирайте PBS/Triton X-100 три раза (по 5-10 минут каждый).</li>
	<li>Нанесите каплю монтажной среды DAPI для маркировки ядер, прежде чем накрыть предметное стекло покровным стеклом. Избегайте образования пузырьков воздуха при размещении покровного стекла.</li>
	<li>Используйте флуоресцентный микроскоп для проверки предметного стекла и получения изображений (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки расположены с помощью DAPI в точке ex/em 359/461 при 10-кратном увеличении для определения местоположения ячеек; Большее увеличение может захватывать клетки. Другие длины волн будут зависеть от выбранного цвета. Зеленый цвет (GFP) - ex/em 488/510. Красный цвет (Cy3) - ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов, которые могли бы иметь отношение к содержанию данной статьи.

Выделение первичного пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) у мышей ранее было задокументировано нашей лабораторией. В данной рукописи подробно описан демонстрационный протокол выделения первичных клеток Мюллера. Эта процедура включает в себя энуклеацию, лечение, диссекцию, сбор, посев,...

Клетки Мюллера (МЦ) являются основными и наиболее распространенными глиальными клетками, обнаруженными в ткани сетчатки. Они играют ключевую роль в обеспечении структурной целостности и метаболических функций в сетчатке1. Стратегическая структура МК распределена по всей толщине сетчатки, тем самым обеспечивая поддержку сетчатки. В дополнение к своим скаффолдоподобным свойствам, они выполняют метаболические функции для нейронов сетчатки, снабжая их энергетическими субстратами, включая глюкозу и лактат. Эти функции имеют решающее значение для поддержания здоровой функции нейронов. Сообщалось, что нарушенные МК способствуют развитию различных заболеваний сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию и глаукому 2,3. МК могут быть эндогенными клеточными источниками для регенеративной терапии в сетчатке1. Они также составляют значительную часть сетчатки, и убедительные данные свидетельствуют о том, что у некоторых видов эти клетки могут быть стимулированы для замены отсутствующихнейронов. Они благотворно взаимодействуют с нейронами, а конически ветвящиеся концевые ноги клеток Мюллера плотно обнажают кровеносные сосуды и соединяют нейронные компоненты сетчатки. Для того чтобы поддерживать развитие нейронов и их пластичность, клетки Мюллера выступают в качестве мягкого субстрата для нейронов, защищая их от механических травм3. Кроме того, при патологических обстоятельствах клетки Мюллера могут дифференцироваться в нейральные предшественники или стволовые клетки, которые реплицируют или регенерируют утраченные фоторецепторы и нейроны 2,3,4. Клетки Мюллера сохраняют характеристики стволовых клеток сетчатки, включая различные уровни потенциала к самообновлению и дифференцировке 5,6. Глиальная клетка Мюллера имеет значительную линию сетчатки, которая продуцирует нейротрофические факторы, поглощает и перерабатывает нейротрансмиттеры, пространственно буферизует ионы и поддерживает гематематический барьер для поддержания сетчатки в гомеостазе 7,8,9. Это подчеркивает потенциал клеток Мюллера в качестве многообещающего инструмента в клеточной терапии для лечения заболеваний, связанных с дегенерацией сетчатки. Клетки Мюллера — это первичная глия, распределенная по всей сетчатке, соединяющаяся как с нейронами, так и с кровеносными сосудами. Они играют решающую защитную роль, обеспечивая необходимую структурную и метаболическую поддержку для поддержания жизнеспособности и стабильности клеток сетчатки. К сожалению, в литературе найдено очень мало протоколов для первичного выделения клеток Мюллера из сетчатки10,11.
Мы представляем усовершенствованный подход к надежной изоляции и культивированию первичных клеток Мюллера у мышей. Этот протокол был использован в нашей группе для выделения клеток Мюллера от мышей дикого типа C57BL/6 и трансгенных мышей12,13. Для этого протокола используются мыши в возрасте от 5 до 11 дней, не имеющие предпочтений по половому признаку. Клетки были пройдены до 4 раз; однако на Р4 они перестают прилипать к колбе, и выращивать здоровую культуру становится сложно. Культура часто контаминируется клетками пигментированного эпителия сетчатки (РПЭ), поэтому клетки должны быть пропущены по крайней мере один раз перед проведением каких-либо дополнительных экспериментов на клеточной линии. Пассаж обеспечивает дальнейшую изоляцию от загрязняющих веществ. Таким образом, представленный протокол предлагает быстрый и эффективный способ выделения мышиных клеток Мюллера, которые затем могут быть использованы в качестве надежной платформы для исследования терапевтических мишеней и оценки потенциальных методовлечения заболеваний сетчатки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

Первичной опорной клеткой сетчатки является глиальная клетка Мюллера сетчатки. Они покрывают всю поверхность сетчатки и находятся в непосредственной близости как к кровеносным сосудам сетчатки, так и к нейронам сетчатки. Из-за своего роста клетки Мюллера выполняют несколько важных задач в здоровой сетчатке, включая поглощение и переработку нейротрансмиттеров, соединений ретиноевой кислоты и ионов (например, калия K+). Помимо регуляции кровотока и поддержания гемато-ретинального барьера, они также регулируют обмен веществ и поступление питательных веществ к сетчатке. В данной рукописи представлена установленная процедура выделения первичных мышиных клеток Мюллера. Чтобы лучше понять молекулярные процессы, лежащие в основе различных моделей глазных заболеваний у мышей, выделение клеток Мюллера является отличным подходом. В данной рукописи подробно описана процедура выделения клеток Мюллера от мышей. От энуклеации до посева весь процесс длится около нескольких часов. В течение 5-7 дней после посева среду не следует менять, чтобы выделенные клетки могли беспрепятственно расти. Далее следует характеристика клеток с использованием морфологии и различных иммунофлуоресцентных маркеров. Максимальные проходы для клеток – 3-4 раза.

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции изолированных клеток Мюллера Чтобы подтвердить жизнеспособность, морфологию и отличительные качества выделенных клеток Мюллера, клетки исследовали под световым микроскопом. Были записаны изображения P0 и P1 (р...

В данной рукописи описан подробный протокол выделения глиальных клеток Мюллера сетчатки из глаз мышей. Протокол начинается с энуклеации и диссекции глаз мыши, за которыми следует выделение, посев и культивирование клеток Мюллера.

Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

923 Views.  Oakland University. В данной рукописи описан подробный протокол выделения глиальных клеток Мюллера сетчатки из глаз мышей. Протокол начинается с энуклеации и диссекции глаз мыши, за которыми следует выделение, посев и культивирование клеток Мюллера.

Video: Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Изоляция кишечных глиальных клеток от подслизистой и Lamina Propria взрослых мыши

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Изоляция, характеристики и высокую пропускную способность внеклеточного Flux анализ мышь первичной почечной трубчатых эпителиальных клеток

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...