Questo lavoro è stato sostenuto dal National Eye Institute (NEI), dal fondo R01 EY029751-04 del National Eye Institute (NEI). Ringraziamo la Dott.ssa Sylvia B. Smith in quanto questo protocollo è stato modificato in base al suo protocollo di isolamento cellulare di Müller.

Tutti gli esperimenti con gli animali sono conformi alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati eseguiti seguendo il nostro protocollo sugli animali approvato dall'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) e dalle politiche dell'Università di Oakland (numero di protocollo 2022-1160)
1. Preparazione dei terreni e della soluzione
<ol><li>Preparare la soluzione Müller cell eye integrando il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, dettagli nella tabella dei materiali) con penicillina/streptomicina alla diluizione di 1:1000. Ad esempio, per 10 ml di DMEM, aggiungere 10 μl di penicillina/streptomicina. NOTA: Questo è un semplice terreno di coltura senza siero preparato. Inoltre, riscaldare l'intero terreno in un bagno d'acqua a 37 °C prima di utilizzarlo per il lavoro di coltura cellulare.</li>
	<li>Preparare un terreno di coltura cellulare Müller primario completo integrando DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS, inattivato termicamente) e l'1% di penicillina/streptomicina. Ad esempio (500 ml di terreno DMEM + 50 ml di FBS + 5 ml di penicillina/streptomicina).</li>
	<li>Preparare una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% con collagenasi IV a una concentrazione di 200 U/mL (la tripsina-EDTA viene utilizzata per sciogliere la quantità calcolata di collagenasi IV polvere per raggiungere la concentrazione necessaria).</li>
</ol>2. Enucleazione
<ol><li>Sopprimere eticamente il topo utilizzando l'inalazione di CO2 seguendo le linee guida IACUC.<ol><li>In breve, posizionare l'animale (o gli animali) nella camera CO2 per introdurre il 100% di CO2 a una velocità di riempimento del 30-70% del volume / min della camera con CO2 per raggiungere l'obiettivo di una rapida perdita di coscienza entro 2-3 minuti con il minimo disagio per i topi.</li>
		<li>Poiché i topi sono in giovane età (~ 10 giorni), eseguire la lussazione cervicale come metodo secondario per garantire una corretta eutanasia.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver sterilizzato l'area di lavoro con etanolo al 70%, posizionare il mouse su un sottopiede sterile.</li>
	<li>Estrarre gli occhi posizionando le braccia delle pinzette nella parte posteriore dell'occhio, tirando delicatamente dall'area orbitale ed enucleando gli occhi applicando pressione con una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per causare la proptosi. NOTA: Sterilizzare gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% seguito da soluzione salina tampone fosfato prima della dissezione.</li>
	<li>Assicurarsi che il nervo ottico sia ancora collegato all'occhio enucleando lentamente l'occhio. Assicurati di tirare il nervo ottico (identificato visivamente come un cordone bianco) dietro l'occhio. NOTA: Questo passaggio non deve essere eseguito al microscopio e può essere eseguito su un banco sterilizzato.</li>
</ol>3. Trattamento degli occhi enucleati
<ol><li>Coprire una provetta da centrifuga da 15 mL con un foglio di alluminio e riempire la provetta con 10 mL della soluzione oculare cellulare Müller.</li>
	<li>Porre gli occhi sezionati nella provetta da 15 mL contenente la soluzione per l'occhio cellulare di Müller e lasciarli riposare per una notte, o circa 18 ore, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo 18 ore, decantare la soluzione oculare e sciacquare brevemente gli occhi con 2-3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) riscaldata (37 °C).</li>
	<li>Decantare il PBS e spostare gli occhi su una piastra di Petri da 100 mm contenente 10 ml di soluzione di tripsina. (preparato al punto 1.3). NOTA: La tripsina viene utilizzata su tutto l'occhio enucleato, agendo come agente dissociativo per facilitare la separazione cellulare dagli strati retinici durante la dissezione. La retina sezionata ha molte cellule, comprese le cellule RPE, che sono appiccicose e hanno maggiori probabilità di contaminare la coltura cellulare di Müller14. L'esame microscopico ha dimostrato chiaramente che dopo 5 giorni di isolamento (durante il primo cambio di terreno), le cellule RPE si sono staccate dalla piastra e sono morte13. Il terreno utilizzato per l'isolamento dell'RPE è il DMEM/F-12, con una composizione diversa rispetto al DMEM (utilizzato nell'isolamento delle cellule di Müller), contenente piruvato di sodio e basso contenuto di glucosio.</li>
	<li>Mettere la capsula in un'incubatrice e incubare per 1,5-2 ore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, trasferire gli occhi in una piastra di Petri da 60 mm contenente circa 5 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo.</li>
</ol>4. Dissezione
NOTA: Questa procedura deve essere eseguita all'interno dell'ambiente sterile della cappa di coltura. Pertanto, è essenziale sterilizzare accuratamente le superfici della cappa con alcol al 70%, insieme a tutti gli strumenti e al microscopio di dissezione. Vale la pena notare che il video è stato registrato all'esterno del cofano per una migliore visibilità e una dimostrazione più chiara.
<ol><li>Metti un piccolo pezzo di tessuto sterilizzato da laboratorio nel piatto per aiutare a stabilizzare gli occhi durante la dissezione. Posizionare gli occhi sotto un microscopio da dissezione per iniziare la dissezione. NOTA: L'uso di tessuto di laboratorio facilita la manovra degli occhi in un piatto pieno di liquido (terreno completo), garantendo una dissezione precisa.</li>
	<li>Usa le forbici Vannas e le pinzette in stile M5S per rimuovere il tessuto connettivo, i muscoli extraoculari e il nervo ottico.<ol><li>Afferra l'occhio con una pinzetta stile M5S e fai un'incisione nella sezione ora serrata con le forbici Vannas o l'ago di una siringa. NOTA: C'è una linea circolare azzurra tra la parte anteriore e quella posteriore dell'occhio chiamata ora serrata, che può essere utilizzata come punto di riferimento per una direzione accurata durante la dissezione.</li>
		<li>Afferrare l'incisione con una pinzetta stile M5S e tirare o strappare la cornea dalla parte posteriore dell'occhio. Tirare in piccoli incrementi per garantire che l'integrità della retina rimanga intatta. NOTA: Questi passaggi servono a rimuovere la parte anteriore dell'occhio (cornea, iride e cristallino) dalla parte posteriore della conchiglia oculare (retine neurali e pigmentate).</li>
		<li>Per mantenere l'integrità degli strati retinici, tirare delicatamente e rimuovere l'epitelio pigmentato retinico dalla retina neurale. La retina neurale dovrebbe essere priva di macchie nere per garantire il più possibile la purezza dell'isolamento, poiché lo strato di RPE è solitamente appiccicoso e attaccato alla retina neuronale.</li>
		<li>Tagliare la retina neurale sezionata in piccoli pezzi prima di raccoglierla in una piastra per garantire una diffusione omogenea delle cellule sulla piastra.</li>
	</ol></li>
	<li>Placcare le retine neurali in un pallone T25 contenente 4 mL di terreno di crescita delle cellule Müller primarie complete.</li>
	<li>Infine, porre il matraccio in un incubatore e incubare a 37 °C e 5% di CO2.</li>
</ol>5. Coltura di cellule gliali primarie di Müller
<ol><li>Non spostare il pallone per 3-5 giorni per favorire la crescita cellulare.</li>
	<li>Cambiare il terreno dopo il quinto giorno e successivamente a giorni alterni fino a quando le celle non sono confluenti al 90%.</li>
</ol>6. Passaggio di cellule gliali primarie di Müller
<ol><li>Aspirare il terreno di coltura cellulare Müller, seguito da 2 mL di lavaggio in PBS, e aspirare il PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (1x), o quanto basta per coprire la piastra.</li>
	<li>Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra al microscopio. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo preriscaldato (37 °C) (preparato nella fase 1.2) nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Centrifugare per 7 min a 300 x g. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo. Poiché il numero di cellule può variare in base al numero di occhi sezionati, quindi, è meglio contare le cellule prima della semina e dell'incubazione. La densità di semina consigliata è di 3,0 x 106 celle in un pallone T75. NOTA: Le celle possono essere passate fino a 4-5 volte. Tuttavia, i risultati più coerenti dell'esperimento si trovano dopo 1-2 passaggi.</li>
</ol>7. Immunofluorescenza
NOTA: Utilizzare il protocollo di immunofluorescenza per colorare e convalidare la specificità delle cellule di Müller. Ecco una breve panoramica del protocollo di immunofluorescenza. Questo passaggio viene eseguito dopo il primo passaggio12.
<ol><li>Seminare le cellule in un vetrino per camera di coltura cellulare (30.000 cellule per pozzetto per un vetrino da 8 pozzetti).</li>
	<li>Coltura delle cellule isolate per 24-48 ore in un terreno di coltura cellulare Müller completo (preparato nella fase 1.2) a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Aspirare il terreno e lavare il vetrino della camera con 250-300 μl di 1x PBS su ciascun pozzetto quando le celle sono confluenti all'80-90%.</li>
	<li>Fissare il vetrino per 10-15 minuti in 250-300 μl di paraformaldeide al 4% su ciascun pozzetto, quindi lavare con PBS/TX-100 (5 minuti ciascuno/3x).</li>
	<li>Aggiungere il tampone di blocco per 1 ora a 37 °C (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Aspirare la soluzione bloccante, quindi aggiungere gli anticorpi primari specifici per le cellule di Müller per confermare la purezza delle cellule isolate utilizzando glutammina sintetasi e vimentina 5,12. Incubare per 3 ore a 37 °C (utilizzando una concentrazione di anticorpi di 1:100-1:200 in tampone bloccante in un volume di 150-200 μL/vetrino). Lavare il vetrino con lavaggi PBS/TX-100 (5 e 10 minuti ciascuno). NOTA: Questi anticorpi sono stati scelti in quanto sono segni distintivi per identificare le cellule di Müller e garantire il successo e la purezza della coltura cellulare di Müller.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo secondario (con una concentrazione di anticorpi compresa tra 1:1000 in tampone bloccante in un vetrino da 150-200 μl/vetrino) e incubare per 1 ora a 37 °C. Quindi, lavare con PBS/Triton X-100, tre volte (5-10 minuti ciascuna).</li>
	<li>Applicare una goccia di terreno di montaggio DAPI per etichettare i nuclei prima di coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti. Evitare la formazione di bolle d'aria quando si posiziona il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare il vetrino e acquisire le immagini (vedi Tabella dei materiali). NOTA: le celle sono localizzate con DAPI a ex/em 359/461 con ingrandimento 10x per localizzare le celle; Un ingrandimento più elevato può catturare le cellule. Altre lunghezze d'onda dipenderebbero dal colore scelto. Colore verde (GFP) - ex/em 488/510. Colore rosso (Cy3) - ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare che siano rilevanti per il contenuto di questo articolo.

L'isolamento dell'epitelio pigmentato retinico primario (RPE) dai topi è stato precedentemente documentato dal nostro laboratorio. Questo manoscritto descrive un protocollo dimostrativo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller. Questa procedura prevede l'enucleazione, il trattamento, la dissezione, la raccolta, la semina, la coltura e la caratterizzazione delle cellule di Müller isolate dagli occhi di topo. Si basa su un protocollo precedentemente riuscito trovato in pubblicazioni precedenti e sul...

Le cellule di Müller (MC) sono le principali e più abbondanti cellule gliali presenti nel tessuto retinico. Sono i principali attori nel fornire integrità strutturale e funzioni metaboliche all'interno della retina1. La struttura strategica delle MC è distribuita su tutto lo spessore della retina, fornendo così supporto alla retina. Oltre alle loro proprietà simili a impalcature, hanno funzioni metaboliche per i neuroni retinici, fornendo loro substrati energetici, tra cui glucosio e lattato. Queste funzioni sono fondamentali per mantenere una sana funzione neuronale. È stato riportato che le MC compromesse contribuiscono a varie malattie della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinopatia diabetica e il glaucoma 2,3. Le MC possono essere fonti cellulari endogene per la terapia rigenerativa nella retina1. Comprendono anche una parte significativa della retina e forti prove suggeriscono che in diverse specie, queste cellule possono essere stimolate a sostituire i neuroni mancanti2. Collaborano in modo benefico con i neuroni e le estremità delle cellule di Müller, ramificate coniche, disintegrano densamente i vasi sanguigni e collegano i componenti neurali della retina. Al fine di mantenere lo sviluppo neuronale e la plasticità neuronale, le cellule di Müller agiscono come un substrato morbido per i neuroni, proteggendoli dai traumi meccanici3. Inoltre, in circostanze patologiche, le cellule di Müller possono differenziarsi in progenitori neurali o cellule staminali che replicano o rigenerano i fotorecettori e i neuroni persi 2,3,4. Le cellule di Müller conservano le caratteristiche delle cellule staminali retiniche, inclusi diversi livelli di potenziale di autorinnovamento e differenziazione 5,6. La cellula gliale di Müller ha un significativo lignaggio retinico che produce fattori neurotrofici, assorbe e ricicla i neurotrasmettitori, tampona spazialmente gli ioni e mantiene la barriera emato-retinica per mantenere la retina in omeostasi 7,8,9. Ciò evidenzia il potenziale delle cellule di Müller come strumento promettente nelle terapie cellulari per il trattamento di malattie legate alla degenerazione retinica. Le cellule di Müller sono la glia primaria distribuita in tutta la retina, che si collega sia ai neuroni che ai vasi sanguigni. Svolgono un ruolo protettivo cruciale, fornendo un supporto strutturale e metabolico essenziale per mantenere la vitalità e la stabilità delle cellule retiniche. Purtroppo, in letteratura si trovano pochissimi protocolli per l'isolamento primario delle cellule di Müller dalla retina10,11.
Presentiamo un approccio avanzato per isolare e coltivare in modo affidabile le cellule primarie di Müller di topo. Questo protocollo è stato utilizzato nel nostro gruppo per isolare le cellule di Müller dai topi C57BL/6 wild-type e dai topi transgenici12,13. Per questo protocollo vengono utilizzati topi di età compresa tra 5 e 11 giorni, senza preferenze di sesso. Le celle sono state attraversate fino a 4 volte; tuttavia, a P4 smettono di aderire al pallone e diventa difficile coltivare una coltura sana. La coltura è spesso contaminata da cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), quindi le cellule devono essere fatte passare almeno una volta prima di eseguire ulteriori esperimenti sulla linea cellulare. Il passaggio consente un ulteriore isolamento dai contaminanti. Pertanto, il protocollo presentato offre un modo rapido ed efficace per isolare le cellule di Müller di topo, che possono quindi essere utilizzate come piattaforma affidabile per la ricerca di bersagli terapeutici e la valutazione di potenziali trattamenti per le malattie della retina14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

La principale cellula di supporto della retina è la cellula gliale retinica di Müller. Coprono l'intera superficie retinica e sono in prossimità sia dei vasi sanguigni retinici che dei neuroni retinici. A causa della loro crescita, le cellule di Müller svolgono diversi compiti cruciali in una retina sana, tra cui l'assorbimento e il riciclaggio di neurotrasmettitori, composti dell'acido retinoico e ioni (come il potassio K+). Oltre a regolare il flusso sanguigno e a mantenere la barriera emato-retinica, regolano anche il metabolismo e l'apporto di sostanze nutritive alla retina. In questo manoscritto viene presentata una procedura consolidata per l'isolamento delle cellule primarie di Müller di topo. Per comprendere meglio i processi molecolari sottostanti coinvolti nei vari modelli murini di disturbi oculari, l'isolamento delle cellule di Müller è un approccio eccellente. Questo manoscritto delinea una procedura dettagliata per l'isolamento delle cellule di Müller dai topi. Dall'enucleazione alla semina, l'intero processo dura circa poche ore. Per 5-7 giorni dopo la semina, il terreno non deve essere cambiato per consentire alle cellule isolate di crescere senza ostacoli. La caratterizzazione cellulare utilizzando la morfologia e i distinti marcatori di immunofluorescenza viene dopo nel processo. I passaggi massimi per le celle sono 3-4 volte.

Validazione della specificità, della purezza e della funzione barriera delle cellule di Müller isolate Per confermare la vitalità, la morfologia e le qualità distintive delle cellule di Müller isolate, le cellule sono state esaminate al microscopio ottico. Sono state registrate immagini P0 e P1 (Figura 1A). Per verificare la contaminazione delle cellule Müller isolate con le cellule RPE e confermarne la purezza, è stata eseguita la colorazione in immunofluorescenza...

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.0K Views.  Oakland University. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Video: Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...