עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים (NEI), המכון הלאומי לעיניים (NEI) קרן R01 EY029751-04. ברצוננו להודות לד"ר סילביה ב. סמית מכיוון שפרוטוקול זה שונה בגרסה בהתבסס על הפרוטוקול שלה לבידוד תאי מולר.

כל הניסויים בבעלי חיים תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ונעשו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שלנו שאושר על ידי ועדת המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ומדיניות אוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מספר 2022-1160)
1. הכנת מדיה ופתרונות
<ol><li>הכן את תמיסת העיניים של תאי Müller על ידי השלמת Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, פרטים בטבלת החומרים) עם פניצילין/סטרפטומיצין בדילול של 1:1000. לדוגמה, עבור 10 מ"ל של DMEM, להוסיף 10 μL של פניצילין/סטרפטומיצין. הערה: זוהי מדיה פשוטה ללא סרום שהוכנה. כמו כן, חממו את המדיה המלאה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה לעבודות תרבית תאים.</li>
	<li>הכינו מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא על ידי תוספת DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS, מומת חום), ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדוגמה (500 מ"ל של מדיה DMEM + 50 מ"ל של FBS + 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין).</li>
	<li>הכינו תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% עם Collagenase IV בריכוז של 200 U/mL (טריפסין-EDTA משמש להמסת הכמות המחושבת של אבקת Collagenase IV כדי להגיע לריכוז הדרוש).</li>
</ol>2. חינוך
<ol><li>המתת חסד אתית של העכבר באמצעות שאיפת CO2 בהתאם להנחיות IACUC.<ol><li>בקצרה, הניחו את בעלי החיים בתא CO2 כדי להחדיר 100% CO2 בקצב מילוי של 30-70% מהנפח של התא עם CO2 כדי להשיג את המטרה של חוסר הכרה מהיר תוך 2-3 דקות עם מצוקה מינימלית לעכברים.</li>
		<li>מכיוון שהעכברים נמצאים בגיל צעיר (~10 ימים), בצעו פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית כדי להבטיח המתת חסד נאותה.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר עיקור אזור העבודה עם 70% אתנול, הניחו את העכבר על כרית תחתונה סטרילית.</li>
	<li>חלץ את העיניים על ידי הנחת זרועות הפינצטה בחלק האחורי של העין, משיכה עדינה מאזור המסלול, והפעלת העיניים על ידי הפעלת לחץ עם פינצטה בסגנון 5/45 לאזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזיס. הערה: יש לעקר את כלי הדיסקציה עם 70% אתנול ולאחר מכן מלח חיץ פוספט לפני הנתיחה.</li>
	<li>ודא כי עצב הראייה עדיין מחובר לעין על ידי enucleating העין לאט. הקפד למשוך את עצב הראייה (מזוהה חזותית כחוט לבן) מאחורי העין. הערה: שלב זה אינו חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ, וניתן לבצע אותו על ספסל מעוקר.</li>
</ol>3. טיפול בעיניים הלומדות
<ol><li>כסו צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ברדיד אלומיניום ומלאו את הצינור ב-10 מ"ל של תמיסת העיניים של תא מולר.</li>
	<li>הניחו את העיניים המנותחות בצינור של 15 מ"ל המכיל תמיסת עיניים של תאי מולר ואפשרו להן לשבת למשך הלילה, או כ-18 שעות, בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר 18 שעות, לרוקן את תמיסת העיניים ולשטוף בקצרה את העיניים עם 2-3 מ"ל של מחומם (37 ° C) פוספט חוצץ מלוחים (PBS).</li>
	<li>דקרו את PBS והזיזו את העיניים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין. (הוכן בשלב 1.3). הערה: טריפסין משמש על כל העין enucleated, מתנהג כסוכן דיסוציאטיבי כדי להקל על הפרדת תאים משכבות הרשתית במהלך דיסקציה. ברשתית המנותחת יש תאים רבים, כולל תאי RPE, שהם דביקים ובעלי הסבירות הגבוהה ביותר לזהם את תרבית תאי מולר14. בדיקה מיקרוסקופית הראתה בבירור כי לאחר 5 ימי בידוד (במהלך שינוי המדיה הראשון), תאי RPE התנתקו מהצלחת ומתו13. המדיה המשמשת לבידוד RPE היא DMEM/F-12, בעלת הרכב שונה מ-DMEM (המשמש לבידוד תאי מולר), המכילה נתרן פירובט וגלוקוז נמוך.</li>
	<li>מניחים את המנה באינקובטור ודגרים במשך 1.5 עד 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, מעבירים את העיניים לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה כ-5 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.</li>
</ol>4. דיסקציה
הערה: הליך זה חייב להתבצע בתוך הסביבה הסטרילית של מכסה המנוע. לפיכך, חיוני לעקר ביסודיות את משטחי מכסה המנוע עם 70% אלכוהול, יחד עם כל הכלים ומיקרוסקופ הדיסקציה. ראוי לציין כי הסרטון הוקלט מחוץ למכסה המנוע לצורך ראות טובה יותר ומטרות הדגמה ברורות יותר.
<ol><li>הניחו חתיכה קטנה של רקמה מעוקרת ברמת מעבדה בצלחת כדי לסייע בייצוב העיניים במהלך הנתיחה. הניחו את העיניים מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להתחיל את הדיסקציה. הערה: השימוש ברקמה ברמת מעבדה מאפשר תמרון של העיניים בכלי מלא נוזל (מדיה שלמה), ומבטיח דיסקציה מדויקת.</li>
	<li>השתמשו במספריים של Vannas ובפינצטה בסגנון M5S כדי להסיר את רקמת החיבור, השרירים החוץ-עיניים ועצב הראייה.<ol><li>תפסו את העין בפינצטה בסגנון M5S ובצעו חתך באזור האורה-סראטה בעזרת מספריים של Vannas או מחט של מזרק. הערה: קיים קו מעגלי בצבע תכלת בין החלק הקדמי והאחורי של העין הנקרא אורה סראטה (ora serrata), אשר יכול לשמש כנקודת ציון לכיווני מדויק במהלך הדיסקציה.</li>
		<li>אחזו את החתך בפינצטה בסגנון M5S ומשכו או קרעו את הקרנית מהחלק האחורי של העין. משכו פנימה במרווחים קטנים כדי להבטיח ששלמות הרשתית תישאר שלמה. הערה: שלבים אלה הם להסיר את החלק הקדמי של העין (קרנית, קשתית ועדשה) מהחלק האחורי של העין (רשתית עצבית ופיגמנטית).</li>
		<li>כדי לשמור על שלמות שכבות הרשתית, משוך בעדינות והסר את אפיתל פיגמנט הרשתית מהרשתית העצבית. הרשתית העצבית צריכה להיות נקייה מכל כתמים שחורים כדי להבטיח את טוהר הבידוד ככל האפשר, שכן שכבת RPE היא בדרך כלל דביקה ומחוברת לרשתית העצבית.</li>
		<li>חתכו את הרשתית העצבית המנותחת לחתיכות קטנות לפני שתאספו אותה בצלחת כדי להבטיח התפשטות הומוגנית של התאים בצלחת.</li>
	</ol></li>
	<li>לוחית את הרשתית העצבית בבקבוק T25 המכיל 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.</li>
	<li>לבסוף, מניחים את הבקבוק באינקובטור ודגרים ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
</ol>5. גידול תאי גליה ראשוניים
<ol><li>אין להזיז את הבקבוק במשך 3-5 ימים כדי לקדם את צמיחת התאים.</li>
	<li>שנה את המדיה לאחר היום החמישי וכל יומיים לאחר מכן עד שהתאים יהיו 90% נפגשים.</li>
</ol>6. מעבר תאי גליה ראשוניים של מולר
<ol><li>שאפו את מדיית תרבית התאים של מולר, ואחריה 2 מ"ל שטיפה ב-PBS, ושאפו החוצה את PBS. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (1x), או מספיק כדי לכסות את הצלחת.</li>
	<li>דוגרים במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ודא שהתאים מנותקים מהצלחת מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, אספו את תרחיף התא והוסיפו 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא שחומם מראש (37°C) (מוכן בשלב 1.2) לצינור האיסוף.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 300 x גרם. לאחר שאיפת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא. מכיוון שמספר התא יכול להשתנות בהתאם למספר העיניים המנותחות, לכן, עדיף לספור את התאים לפני הזריעה והדגירה. צפיפות הזריעה המומלצת היא 3.0 x 106 תאים בצלוחית T75. הערה: ניתן להעביר תאים עד 4-5 פעמים. עם זאת, תוצאות הניסוי העקביות ביותר נמצאות לאחר 1-2 מעברים.</li>
</ol>7. Immunofluorescence
הערה: השתמש בפרוטוקול immunofluorescence כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של תאי Müller. להלן סקירה קצרה של פרוטוקול immunofluorescent. שלב זה מבוצע לאחר הקטע הראשון12.
<ol><li>זרעו את התאים בשקופית תא תרבית תאים (30,000 תאים לבאר עבור שקופית של 8 בארות).</li>
	<li>תרבית את התאים המבודדים במשך 24-48 שעות בתווך תרבית תאי מולר שלם (מוכן בשלב 1.2) ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>שאפו החוצה את המדיה ושטפו את שקופית התא עם 250-300 μL של 1x PBS על כל באר כאשר התאים הם 80-90% במפגש.</li>
	<li>תקן את המגלשה למשך 10 עד 15 דקות ב 250-300 μL של 4% paraformaldehyde על כל באר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS / TX-100 (5 דקות כל אחד / 3x).</li>
	<li>הוסף מאגר חוסם למשך שעה אחת ב- 37°C (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>יש לשאוף את התמיסה החוסמת, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים הראשוניים הספציפיים לתאי מולר כדי לאשר את טוהר התאים המבודדים באמצעות גלוטמין סינטטאז ווימנטין 5,12. דגירה במשך 3 שעות ב-37°C (באמצעות ריכוז נוגדנים של 1:100-1:200 בחיץ חוסם בנפח של 150-200 μL/slide). שטפו את המגלשה בשטיפות PBS/TX-100 (5 ו-10 דקות כל אחת). הערה: נוגדנים אלה נבחרו מכיוון שהם סימני היכר לזיהוי תאי מולר ולהבטחת ההצלחה והטוהר של תרבית תאי מולר.</li>
	<li>מוסיפים את הנוגדן המשני (עם ריכוז נוגדנים שנע בין 1:1000 בחיץ חוסם ב-150-200 מיקרוליטר/שקופית) ודגרים במשך שעה אחת ב-37°C. לאחר מכן, שטפו עם PBS/Triton X-100, שלוש פעמים (5-10 דקות כל אחת).</li>
	<li>החל טיפה של אמצעי הרכבה DAPI כדי לתייג את הגרעינים לפני כיסוי השקופית בכיסוי. הימנעו מבועות אוויר בעת הנחת הכיסוי.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את השקופית וללכוד תמונות (ראה טבלת חומרים). הערה: תאים ממוקמים עם DAPI ב- ex/em 359/461 בהגדלה של 10x כדי לאתר תאים; הגדלה גבוהה יותר יכולה ללכוד תאים. אורכי גל אחרים יהיו תלויים בצבע הנבחר. צבע ירוק (GFP)- ex/em 488/510. צבע אדום (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר כי הם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.

הבידוד של אפיתל פיגמנטי רשתית ראשוני (RPE) מעכברים תועד בעבר על ידי המעבדה שלנו. כתב יד זה מתאר פרוטוקול הדגמה מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים. הליך זה כולל חינוך, טיפול, נתיחה, איסוף, זריעה, תרבית ואפיון של תאי מולר שבודדו מעיני עכבר. הוא מבוסס על פרוטוקול מוצלח בעבר שנמצא בפרסומים קודמים ועל ה...

תאי מולר (MCs) הם תאי הגליה העיקריים והנפוצים ביותר הנמצאים ברקמת הרשתית. הם שחקני המפתח במתן שלמות מבנית ותפקודים מטבוליים בתוך הרשתית1. המבנה האסטרטגי של MCs מתפרש על פני כל עובי הרשתית, ובכך מספק תמיכה לרשתית. בנוסף לתכונות דמויות הפיגומים שלהם, יש להם פונקציות מטבוליות עבור נוירונים ברשתית, המספקים להם מצעי אנרגיה, כולל גלוקוז ולקטט. תפקודים אלה חיוניים על מנת לשמור על תפקוד עצבי בריא. דווח כי MCs לקויים תורמים למחלות רשתית שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטינופתיה סוכרתית וגלאוקומה 2,3. MCs יכולים להיות מקורות תאיים אנדוגניים לטיפול רגנרטיבי ברשתית1. הם גם מהווים חלק משמעותי מהרשתית, וראיות חזקות מצביעות על כך שבכמה מינים, תאים אלה יכולים להיות מעוררים להחליף נוירונים חסרים2. הם משתפים פעולה באופן מועיל עם נוירונים, וכפות הרגליים הסופיות של תאי מולר המסתעפים בחרוט פותחות בצפיפות את כלי הדם ומחברות את המרכיבים העצביים של הרשתית. על מנת לשמור על התפתחות עצבית ופלסטיות עצבית, תאי מולר משמשים כמצע רך לנוירונים, ומגינים עליהם מפני טראומה מכנית3. בנוסף, בנסיבות פתולוגיות, תאי מולר עשויים להתמיין לאבות עצביים או תאי גזע המשכפלים או מחדשים את הפוטורצפטורים והנוירוניםשאבדו 2,3,4. תאי מולר שומרים על המאפיינים של תאי גזע ברשתית, כולל רמות שונות של פוטנציאל להתחדשות עצמית והתמיינות 5,6. לתא הגליה של מולר יש שושלת רשתית משמעותית המייצרת גורמים נוירוטרופיים, סופגת וממחזרת מוליכים עצביים, חוצצת יונים מרחבית ושומרת על מחסום הדם-רשתית על מנת לשמור על הרשתית בהומאוסטזיס 7,8,9. זה מדגיש את הפוטנציאל של תאי מולר ככלי מבטיח בטיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות הקשורות לניוון הרשתית. תאי מולר הם תאי הגליה העיקריים המפוזרים ברחבי הרשתית, ומתחברים הן לנוירונים והן לכלי הדם. הם ממלאים תפקיד הגנה חיוני, ומספקים תמיכה מבנית ומטבולית חיונית לשמירה על הכדאיות והיציבות של תאי הרשתית. למרבה הצער, מעט מאוד פרוטוקולים נמצאים בספרות לבידוד תאי מולר ראשוניים מהרשתית10,11.
אנו מציגים גישה משופרת לבידוד וטיפוח אמינים של תאי מולר ראשוניים של עכברים. פרוטוקול זה שימש בקבוצה שלנו כדי לבודד תאי מולר מעכברי בר מסוג C57BL/6 ועכברים טרנסגניים12,13. עכברים בגילאי 5 עד 11 ימים, ללא העדפת מין, משמשים לפרוטוקול זה. תאים עברו עד 4 פעמים; עם זאת, ב P4 הם מפסיקים לדבוק צלוחיות, וזה הופך להיות קשה לגדל תרבות בריאה. התרבית מזוהמת לעתים קרובות בתאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE), ולכן יש להעביר את התאים לפחות פעם אחת לפני ביצוע ניסויים נוספים בקו התא. המעבר מאפשר בידוד נוסף ממזהמים. לכן, הפרוטוקול שהוצג מציע דרך מהירה ויעילה לבודד תאי מולר עכבר, אשר לאחר מכן יכול לשמש פלטפורמה אמינה לחקר מטרות טיפוליות והערכת טיפולים פוטנציאליים למחלות רשתית14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

התא התומך העיקרי ברשתית הוא תא מולר גליית הרשתית. הם מכסים את כל פני הרשתית ונמצאים בסמיכות הן לכלי הדם ברשתית והן לנוירונים ברשתית. בגלל גדילתם, תאי מולר מבצעים מספר משימות חיוניות ברשתית בריאה, כולל ספיגה ומיחזור של מוליכים עצביים, תרכובות חומצה רטינואית ויונים (כמו אשלגן K+). בנוסף להסדרת זרימת הדם ושמירה על מחסום הדם-רשתית, הם גם מווסתים את חילוף החומרים ואת אספקת החומרים המזינים לרשתית. נוהל מבוסס לבידוד תאי מולר ראשוניים של עכבר מוצג בכתב יד זה. כדי להבין טוב יותר את התהליכים המולקולריים הבסיסיים המעורבים במודלים עכבריים שונים של הפרעות עיניים, בידוד תאי מולר הוא גישה מצוינת. כתב יד זה מתאר הליך מפורט לבידוד תאי מולר מעכברים. מהאינוקלציה ועד הזריעה, התהליך כולו נמשך כמספר שעות. במשך 5-7 ימים לאחר הזריעה, אין לשנות את המדיה על מנת לאפשר לתאים המבודדים לגדול ללא הפרעה. אפיון תאים באמצעות מורפולוגיה וסמנים אימונופלואורסצנטיים מובחנים הוא השלב הבא בתהליך. המעברים המרביים לתאים הם 3-4 פעמים.

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום של תאי מולר מבודדים כדי לאשר את הכדאיות, המורפולוגיה והתכונות הייחודיות של תאי מולר המבודדים, התאים נבדקו תחת מיקרוסקופ אור. תועדו תמונות P0 ו-P1 (איור 1A). כדי לבדוק את הזיהום של תאי מולר מבודדים בתאי RPE ולאשר את טוהרו, בוצעה צביע?...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

923 Views.  Oakland University. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

Video: בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...