Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), le fonds R01 EY029751-04 du National Eye Institute (NEI). Nous tenons à remercier la Dre Sylvia B. Smith, car ce protocole a été modifié sur la base de son protocole d’isolement des cellules de Müller.

Toutes les expériences sur des animaux étaient conformes à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été réalisées conformément à notre protocole sur les animaux approuvé par le comité de l’Institute for Animal Care and Use (IACUC) et aux politiques de l’Université d’Oakland (numéro de protocole 2022-1160)
1. Préparation du milieu et de la solution
<ol><li>Préparez la solution oculaire à cellules de Müller en complétant le milieu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, détails dans le tableau des matériaux) avec de la pénicilline/streptomycine à la dilution de 1:1000. Par exemple, pour 10 ml de DMEM, ajoutez 10 μL de pénicilline/streptomycine. REMARQUE : Il s’agit d’un simple milieu sans sérum préparé. Réchauffez également l’ensemble du milieu dans un bain-marie à 37 °C avant de l’utiliser pour des travaux de culture cellulaire.</li>
	<li>Préparez un milieu de croissance cellulaire primaire complet en complétant le DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS, inactivé par la chaleur) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Par exemple (500 ml de média DMEM + 50 ml de FBS + 5 ml de pénicilline/streptomycine).</li>
	<li>Préparez une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % avec de la collagénase IV à une concentration de 200 U/mL (la trypsine-EDTA est utilisée pour dissoudre la quantité calculée de poudre de collagénase IV afin d’atteindre la concentration nécessaire).</li>
</ol>2. L’énucléation
<ol><li>Euthanasier éthiquement la souris en utilisant l’inhalation de CO2 conformément aux directives de l’IACUC.<ol><li>Brièvement, placez le ou les animaux dans la chambre de CO2 pour introduire 100 % de CO2 à un taux de remplissage de 30 à 70 % de la chambre vol/min avec du CO2 afin d’atteindre l’objectif d’une perte de conscience rapide en 2 à 3 minutes avec une détresse minimale pour les souris.</li>
		<li>Étant donné que les souris sont à un jeune âge (~10 jours), effectuez une luxation cervicale comme méthode secondaire pour assurer une euthanasie appropriée.</li>
	</ol></li>
	<li>Après avoir stérilisé la zone de travail avec de l’éthanol à 70 %, placez la souris sur un sous-tampon stérile.</li>
	<li>Extrayez les yeux en plaçant les bras de la pince à épiler à l’arrière de l’œil, en tirant doucement sur la zone orbitaire et en isolant les yeux en appliquant une pression avec une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitaire pour provoquer une proptose. REMARQUE : Stérilisez les outils de dissection avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution saline tampon phosphate avant la dissection.</li>
	<li>Assurez-vous que le nerf optique est toujours connecté à l’œil en incubant lentement l’œil. Assurez-vous de tirer le nerf optique (identifié visuellement comme un cordon blanc) derrière l’œil. REMARQUE : Cette étape n’a pas besoin d’être effectuée au microscope et peut être effectuée sur une paillasse stérilisée.</li>
</ol>3. Traitement des yeux énucléés
<ol><li>Couvrez un tube à centrifuger de 15 ml avec du papier d’aluminium et remplissez le tube avec 10 ml de la solution pour les yeux à cellules Müller.</li>
	<li>Placez les yeux disséqués dans le tube de 15 mL contenant la solution pour les yeux à cellules de Müller et laissez-les reposer toute la nuit, soit environ 18 h, à température ambiante.</li>
	<li>Après 18 h, décantez la solution pour les yeux et rincez-les brièvement avec 2 à 3 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) réchauffée (37 °C).</li>
	<li>Décantez le PBS et placez les yeux dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de solution de trypsine. (préparé à l’étape 1.3). REMARQUE : La trypsine est utilisée sur l’ensemble de l’œil énucléé, agissant comme un agent dissociatif pour faciliter la séparation cellulaire des couches rétiniennes pendant la dissection. La rétine disséquée contient de nombreuses cellules, y compris des cellules EPR, qui sont collantes et sont les plus susceptibles de contaminer la culture cellulaire de Müller14. L’examen microscopique a clairement montré qu’après 5 jours d’isolement (lors du premier changement de milieu), les cellules EPR se sont détachées de la plaque et sont mortes13. Le milieu utilisé pour l’isolement de l’EPR est le DMEM/F-12, avec une composition différente de celle du DMEM (utilisé dans l’isolement des cellules de Müller), contenant du pyruvate de sodium et une faible teneur en glucose.</li>
	<li>Placez le plat dans un incubateur et incubez pendant 1,5 à 2 h à 37 °C et 5% de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, transférez les yeux dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant environ 5 ml de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet.</li>
</ol>4. Dissection
REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée dans l’environnement stérile de la hotte de culture. Par conséquent, il est essentiel de stériliser soigneusement les surfaces de la hotte avec de l’alcool à 70%, ainsi que tous les outils et le microscope de dissection. Il convient de noter que la vidéo a été enregistrée à l’extérieur du capot pour une meilleure visibilité et des démonstrations plus claires.
<ol><li>Placez un petit morceau de tissu de laboratoire stérilisé dans la boîte pour aider à stabiliser les yeux pendant la dissection. Placez les yeux sous un microscope à dissection pour commencer la dissection. REMARQUE : L’utilisation de tissu de qualité laboratoire facilite la manœuvre des yeux dans une boîte remplie de liquide (milieu complet), assurant une dissection précise.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux Vannas et une pince à épiler de type M5S pour enlever le tissu conjonctif, les muscles extraoculaires et le nerf optique.<ol><li>Saisissez l’œil avec une pince à épiler de style M5S et faites une incision dans la section ora serrata avec des ciseaux Vannas ou une aiguille de seringue. REMARQUE : Il y a une ligne circulaire bleu clair entre la partie antérieure et postérieure de l’œil appelée ora serrata, qui peut être utilisée comme point de repère pour une direction précise pendant la dissection.</li>
		<li>Saisissez l’incision à l’aide d’une pince à épiler de type M5S et tirez ou déchirez la cornée de la partie postérieure de l’œil. Tirez par petits incréments pour vous assurer que l’intégrité de la rétine reste intacte. REMARQUE : Ces étapes consistent à retirer la partie antérieure de l’œil (cornée, iris et cristallin) de la partie postérieure de l’œilleton (rétines neurales et pigmentées).</li>
		<li>Pour maintenir l’intégrité des couches rétiniennes, tirez doucement et retirez l’épithélium pigmenté rétinien de la rétine neurale. La rétine neurale doit être exempte de toute tache noire pour assurer autant que possible la pureté de l’isolement, car la couche RPE est généralement collante et attachée à la rétine neuronale.</li>
		<li>Coupez la rétine neurale disséquée en petits morceaux avant de la rassembler dans une plaque pour assurer une répartition homogène des cellules sur la plaque.</li>
	</ol></li>
	<li>Placez les rétines neurales dans une fiole T25 contenant 4 mL de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet.</li>
	<li>Enfin, placez le ballon dans un incubateur et incubez à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
</ol>5. Culture de cellules gliales primaires de Müller
<ol><li>Ne déplacez pas le flacon pendant 3 à 5 jours pour favoriser la croissance cellulaire.</li>
	<li>Changez de milieu après le cinquième jour et tous les deux jours par la suite jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.</li>
</ol>6. Passage des cellules gliales primaires de Müller
<ol><li>Aspirer le milieu de culture cellulaire Müller, puis appliquer 2 mL de lavage dans du PBS et aspirer le PBS. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (1x), ou assez pour couvrir l’assiette.</li>
	<li>Incuber pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Assurez-vous que les cellules sont détachées de la plaque au microscope. Ensuite, prélever la suspension cellulaire et ajouter 4 ml de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet préchauffé (37 °C) (préparé à l’étape 1.2) dans le tube de prélèvement.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 7 min à 300 x g. Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet. Étant donné que le nombre de cellules peut varier en fonction du nombre d’yeux disséqués, il est donc préférable de compter les cellules avant l’ensemencement et l’incubation. La densité de semis recommandée est de 3,0 x 106 cellules dans une fiole T75. REMARQUE : Les cellules peuvent être traversées jusqu’à 4-5 fois. Cependant, les résultats d’expérience les plus cohérents se trouvent après 1 à 2 passages.</li>
</ol>7. Immunofluorescence
REMARQUE : Utilisez le protocole d’immunofluorescence pour colorer et valider la spécificité des cellules de Müller. Voici un bref aperçu du protocole d’immunofluorescence. Cette étape est effectuée après le premier passage12.
<ol><li>Ensemencez les cellules dans une lame de chambre de culture cellulaire (30 000 cellules par puits pour une lame de chambre à 8 puits).</li>
	<li>Cultivez les cellules isolées pendant 24 à 48 h dans un milieu de culture cellulaire Müller complet (préparé à l’étape 1.2) à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Aspirez le média et lavez la lame de la chambre avec 250-300 μL de 1x PBS sur chaque puits lorsque les cellules sont confluentes à 80-90%.</li>
	<li>Fixez la lame pendant 10 à 15 minutes dans 250-300 μL de paraformaldéhyde à 4 % sur chaque puits, suivie d’un lavage avec PBS/TX-100 (5 min chacun/3x).</li>
	<li>Ajouter un tampon de blocage pendant 1 h à 37 °C (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Aspirez la solution bloquante, puis ajoutez les anticorps primaires spécifiques des cellules de Müller pour confirmer la pureté des cellules isolées à l’aide de la glutamine synthétase et de la vimentine 5,12. Incuber pendant 3 h à 37 °C (en utilisant une concentration d’anticorps de 1:100-1:200 dans un tampon de blocage dans un volume de 150-200 μL/lame). Lavez la diapositive avec des lavages PBS/TX-100 (5 et 10 min chacun). REMARQUE : Ces anticorps ont été choisis car ils sont caractéristiques de l’identification des cellules de Müller et de la garantie du succès et de la pureté de la culture de cellules de Müller.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps secondaire (avec une concentration d’anticorps allant de 1:1000 dans un tampon de blocage dans une lame de 150 à 200 μL) et incuber pendant 1 h à 37 °C. Ensuite, lavez avec PBS/Triton X-100, trois fois (5 à 10 minutes chacune).</li>
	<li>Appliquez une goutte de support de montage DAPI pour étiqueter les noyaux avant de recouvrir la lame avec une lamelle. Évitez les bulles d’air lors de la mise en place de la lamelle.</li>
	<li>Utilisez un microscope fluorescent pour vérifier la lame et capturer des images (voir la table des matériaux). REMARQUE : Les cellules sont localisées avec DAPI à ex/em 359/461 à un grossissement de 10x pour localiser les cellules ; Un grossissement plus élevé peut capturer des cellules. D’autres longueurs d’onde dépendraient de la couleur choisie. Couleur verte (GFP)- ex/em 488/510. Couleur rouge (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer qui soit pertinent pour le contenu de cet article.

L’isolement de l’épithélium pigmenté rétinien primaire (EPR) chez la souris a déjà été documenté par notre laboratoire. Ce manuscrit décrit un protocole de démonstration détaillé pour l’isolement des cellules primaires de Müller. Cette procédure implique l’énucléation, le traitement, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation de cellules de Müller isolées dans des yeux de souris. Il est basé sur un protocole précédemment couronné de succès trouvé dans...

Les cellules de Müller (MC) sont les cellules gliales principales et les plus abondantes présentes dans le tissu rétinien. Ils sont les acteurs clés de l’intégrité structurelle et des fonctions métaboliques au sein de la rétine1. La structure stratégique des MC est répartie sur toute l’épaisseur de la rétine, fournissant ainsi un soutien à la rétine. En plus de leurs propriétés d’échafaudage, ils ont des fonctions métaboliques pour les neurones rétiniens, leur fournissant des substrats énergétiques, notamment le glucose et le lactate. Ces fonctions sont cruciales pour maintenir une fonction neuronale saine. Il a été rapporté que les MC altérés contribuent à diverses maladies rétiniennes, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et le glaucome 2,3. Les MC peuvent être des sources cellulaires endogènes pour la thérapie régénérative dans la rétine1. Elles comprennent également une partie importante de la rétine, et des preuves solides suggèrent que chez plusieurs espèces, ces cellules peuvent être stimulées pour remplacer les neurones manquants2. Ils collaborent avantageusement avec les neurones, et les extrémités des cellules de Müller à ramification conique dégainent densément les vaisseaux sanguins et relient les composants neuronaux de la rétine. Afin de maintenir le développement neuronal et la plasticité neuronale, les cellules de Müller agissent comme un substrat mou pour les neurones, les protégeant des traumatismes mécaniques3. De plus, dans des circonstances pathologiques, les cellules de Müller peuvent se différencier en progéniteurs neuraux ou en cellules souches qui répliquent ou régénèrent les photorécepteurs et les neurones perdus 2,3,4. Les cellules de Müller conservent les caractéristiques des cellules souches rétiniennes, y compris différents niveaux de potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation 5,6. La cellule gliale de Müller possède une lignée rétinienne significative qui produit des facteurs neurotrophiques, absorbe et recycle les neurotransmetteurs, tamponne spatialement les ions et maintient la barrière hémato-rétinienne afin de maintenir la rétine en homéostasie 7,8,9. Cela met en évidence le potentiel des cellules de Müller en tant qu’outil prometteur dans les thérapies cellulaires pour traiter les maladies liées à la dégénérescence rétinienne. Les cellules de Müller sont les cellules gliales primaires réparties dans toute la rétine, se connectant à la fois aux neurones et aux vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle protecteur crucial, fournissant un soutien structurel et métabolique essentiel pour maintenir la viabilité et la stabilité des cellules rétiniennes. Malheureusement, très peu de protocoles sont trouvés dans la littérature pour l’isolement des cellules primaires de Müller de la rétine10,11.
Nous présentons une approche améliorée pour isoler et cultiver de manière fiable des cellules primaires de Müller de souris. Ce protocole a été utilisé dans notre groupe pour isoler les cellules de Müller des souris C57BL/6 de type sauvage et des souris transgéniques 12,13. Des souris âgées de 5 à 11 jours, sans préférence sexuelle, sont utilisées pour ce protocole. Les cellules ont été traversées jusqu’à 4 fois ; cependant, à P4, ils cessent d’adhérer au ballon et il devient difficile de cultiver une culture saine. La culture est souvent contaminée par des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR), de sorte que les cellules doivent être passées au moins une fois avant d’effectuer des expériences supplémentaires sur la lignée cellulaire. Le passage permet une meilleure isolation des contaminants. Par conséquent, le protocole présenté offre un moyen rapide et efficace d’isoler les cellules de Müller de souris, qui peuvent ensuite être utilisées comme une plate-forme fiable pour rechercher des cibles thérapeutiques et évaluer des traitements potentiels pour les maladies de la rétine14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

La principale cellule de soutien de la rétine est la cellule gliale de Müller. Ils couvrent toute la surface de la rétine et se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins de la rétine et des neurones rétiniens. En raison de leur croissance, les cellules de Müller effectuent plusieurs tâches cruciales dans une rétine saine, notamment l’absorption et le recyclage des neurotransmetteurs, des composés de l’acide rétinoïque et des ions (comme le potassium K+). En plus de réguler le flux sanguin et de maintenir la barrière hémato-rétinienne, ils régulent également le métabolisme et l’apport de nutriments à la rétine. Une procédure établie pour isoler les cellules primaires de Müller de souris est présentée dans ce manuscrit. Pour mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents impliqués dans les différents modèles murins de troubles oculaires, l’isolement cellulaire de Müller est une excellente approche. Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour l’isolement des cellules de Müller chez la souris. De l’énucléation à l’ensemencement, l’ensemble du processus dure environ quelques heures. Pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, le substrat ne doit pas être changé afin de permettre aux cellules isolées de se développer sans entrave. La caractérisation cellulaire à l’aide de la morphologie et de marqueurs immunofluorescents distincts vient ensuite dans le processus. Le nombre maximum de passages pour les cellules est de 3 à 4 fois.

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction barrière des cellules de Müller isolées Pour confirmer la viabilité, la morphologie et les qualités distinctives des cellules de Müller isolées, les cellules ont été examinées au microscope optique. Des images P0 et P1 ont été enregistrées (Figure 1A). Pour vérifier la contamination des cellules de Müller isolées par des cellules EPR et confirmer leur pureté, une coloration par immunofluoresc...

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.1K vues.  Oakland University. Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Vidéo: Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Recherche

Biologie

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolement des cellules immunitaires des tumeurs primitives

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...