Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute (NEI), The National Eye Institute (NEI) fundo R01 EY029751-04. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sylvia B. Smith, pois este protocolo foi modificado com base em seu protocolo de isolamento de células de Müller.

Todos os experimentos com animais estavam em conformidade com a declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram feitos seguindo nosso protocolo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pelas políticas da Universidade de Oakland (número de protocolo 2022-1160)
1. Preparação de meios e soluções
<ol><li>Preparar a solução de olho de células de Müller suplementando o meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM, pormenores na tabela de materiais) com penicilina/estreptomicina na diluição de 1:1000. Por exemplo, para 10 mL de DMEM, adicione 10 μL de penicilina/estreptomicina. NOTA: Este é um meio simples e sem soro preparado. Além disso, aqueça o meio completo em banho-maria a 37 °C antes de usá-lo para o trabalho de cultura de células.</li>
	<li>Prepare o meio de crescimento primário completo de células de Müller suplementando o DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS, inativado pelo calor) e 1% de penicilina/estreptomicina. Por exemplo (500 mL de meio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Prepare uma solução de tripsina-EDTA a 0,05% com colagenase IV a uma concentração de 200 U / mL (a tripsina-EDTA é usada para dissolver a quantidade calculada de pó de colagenase IV para atingir a concentração necessária).</li>
</ol>2. Enucleação
<ol><li>Eutanasiar eticamente o camundongo usando a inalação de CO2 seguindo as diretrizes da IACUC.<ol><li>Resumidamente, coloque o(s) animal(is) na câmara de CO2 para introduzir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 30-70% da câmara vol/min com CO2 para atingir o objetivo de inconsciência rápida dentro de 2-3 min com o mínimo de sofrimento para os camundongos.</li>
		<li>Como os camundongos são jovens (~ 10 dias), realize a luxação cervical como método secundário para garantir a eutanásia adequada.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois de esterilizar a área de trabalho com etanol a 70%, coloque o mouse em uma almofada estéril.</li>
	<li>Extraia os olhos colocando os braços da pinça na parte de trás do olho, puxando suavemente da área orbital e enucleando os olhos aplicando pressão com uma pinça estilo 5/45 na área orbital para causar proptose. NOTA: Esterilize as ferramentas de dissecção com etanol a 70% seguido de solução salina tampão fosfato antes da dissecção.</li>
	<li>Certifique-se de que o nervo óptico ainda esteja conectado ao olho, enucleando o olho lentamente. Certifique-se de puxar o nervo óptico (visualmente identificado como um cordão branco) atrás do olho. NOTA: Esta etapa não precisa ser realizada ao microscópio e pode ser realizada em uma bancada esterilizada.</li>
</ol>3. Tratamento dos olhos enucleados
<ol><li>Cubra um tubo de centrífuga de 15 mL com papel alumínio e encha o tubo com 10 mL da solução de olho de células de Müller.</li>
	<li>Coloque os olhos dissecados no tubo de 15 ml contendo a solução ocular de células de Müller e deixe-os repousar durante a noite, ou cerca de 18 h, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após 18 h, decantar a solução para os olhos e enxaguar brevemente os olhos com 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) aquecida (37 °C).</li>
	<li>Transvasar o PBS e deslocar os olhos para uma placa de Petri de 100 mm contendo 10 ml de solução de tripsina. (preparado na etapa 1.3). NOTA: A tripsina é usada em todo o olho enucleado, atuando como um agente dissociativo para facilitar a separação celular das camadas da retina durante a dissecção. A retina dissecada tem muitas células, incluindo células RPE, que são pegajosas e mais propensas a contaminar a cultura de células de Müller14. O exame microscópico demonstrou claramente que, após 5 dias de isolamento (durante a primeira troca de meio), as células do EPR se desprenderam da placa e morreram13. O meio utilizado para isolamento de EPR é o DMEM/F-12, com composição diferente do DMEM (utilizado no isolamento de células de Müller), contendo piruvato de sódio e baixo teor de glicose.</li>
	<li>Coloque o prato em uma incubadora e incube por 1,5 a 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, transfira os olhos para uma placa de Petri de 60 mm contendo cerca de 5 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.</li>
</ol>4. Dissecção
NOTA: Este procedimento deve ser realizado dentro do ambiente estéril da capela de cultura. Portanto, é essencial esterilizar completamente as superfícies do exaustor com álcool 70%, juntamente com todas as ferramentas e o microscópio de dissecação. Vale ressaltar que o vídeo foi gravado fora do capô para melhor visibilidade e demonstração mais clara.
<ol><li>Coloque um pequeno pedaço de tecido esterilizado de laboratório no prato para ajudar a estabilizar os olhos durante a dissecção. Coloque os olhos sob um microscópio de dissecação para iniciar a dissecção. NOTA: O uso de tecido de laboratório facilita a manobra dos olhos em um prato cheio de líquido (meio completo), garantindo uma dissecção precisa.</li>
	<li>Use uma tesoura Vannas e uma pinça estilo M5S para remover o tecido conjuntivo, os músculos extraoculares e o nervo óptico.<ol><li>Segure o olho com uma pinça estilo M5S e faça uma incisão na seção ora serrata com uma tesoura Vannas ou uma agulha de seringa. NOTA: Existe uma linha circular azul clara entre a parte anterior e posterior do olho chamada ora serrata, que pode ser usada como um ponto de referência para uma direção precisa durante a dissecção.</li>
		<li>Segure a incisão com uma pinça estilo M5S e puxe ou rasgue a córnea da parte posterior do olho. Puxe em pequenos incrementos para garantir que a integridade da retina permaneça intacta. NOTA: Essas etapas são para remover a parte anterior do olho (córnea, íris e cristalino) da parte posterior da ocular (retinas neurais e pigmentadas).</li>
		<li>Para manter a integridade das camadas da retina, puxe suavemente e remova o epitélio pigmentado da retina da retina neural. A retina neural deve estar livre de manchas pretas para garantir a pureza do isolamento o máximo possível, pois a camada de EPR geralmente é pegajosa e presa à retina neuronal.</li>
		<li>Corte a retina neural dissecada em pequenos pedaços antes de coletá-la em uma placa para garantir uma distribuição homogênea das células na placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar as retinas neurais em um frasco T25 contendo 4 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.</li>
	<li>Por fim, colocar o balão numa incubadora e incubar a 37 °C e 5% de CO2.</li>
</ol>5. Cultura de células gliais primárias de Müller
<ol><li>Não mova o frasco por 3-5 dias para promover o crescimento celular.</li>
	<li>Troque a mídia após o quinto dia e a cada dois dias até que as células estejam 90% confluentes.</li>
</ol>6. Passagem de células gliais primárias de Müller
<ol><li>Aspirar o meio de cultura de células de Müller, seguido de 2 ml de lavagem em PBS, e aspirar o PBS. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (1x), ou o suficiente para cobrir a placa.</li>
	<li>Incube por 5-10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Certifique-se de que as células estejam separadas da placa sob o microscópio. Em seguida, recolha a suspensão celular e adicione 4 ml de meios de crescimento primários completos de células de Müller pré-aquecidos (37 °C) (preparados no passo 1.2) ao tubo de recolha.</li>
	<li>Centrifugue por 7 min a 300 x g. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller. Como o número de células pode variar de acordo com o número de olhos dissecados, é melhor contar as células antes da semeadura e incubação. A densidade de semeadura recomendada é de 3,0 x 106 células em um balão T75. NOTA: As células podem ser passadas até 4-5 vezes. No entanto, os resultados mais consistentes do experimento são encontrados após 1-2 passagens.</li>
</ol>7. Imunofluorescência
NOTA: Use o protocolo de imunofluorescência para corar e validar a especificidade das células de Müller. Aqui está uma breve visão geral do protocolo de imunofluorescência. Esta etapa é realizada após a primeira passagem12.
<ol><li>Semeie as células em uma lâmina de câmara de cultura celular (30.000 células por poço para uma lâmina de câmara de 8 poços).</li>
	<li>Cultivar as células isoladas durante 24-48 h num meio de cultura de células Müller completo (preparado no passo 1.2) a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire o meio e lave a lâmina da câmara com 250-300 μL de 1x PBS em cada poço quando as células estiverem 80-90% confluentes.</li>
	<li>Fixe a lâmina por 10 a 15 min em 250-300 μL de paraformaldeído a 4% em cada poço, seguido de lavagem com PBS / TX-100 (5 min cada / 3x).</li>
	<li>Adicionar tampão de bloqueio durante 1 h a 37 °C (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aspirar a solução de bloqueio e, em seguida, adicionar os anticorpos primários específicos para as células de Müller para confirmar a pureza das células isoladas utilizando glutamina sintetase e vimentina 5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando uma concentração de anticorpos de 1:100-1:200 em tampão de bloqueio num volume de 150-200 μL/lâmina). Lave a lâmina com PBS/TX-100 lavagens (5 e 10 min cada). NOTA: Esses anticorpos foram escolhidos por serem características para identificar células de Müller e garantir o sucesso e a pureza da cultura de células de Müller.</li>
	<li>Adicione o anticorpo secundário (com uma concentração de anticorpos variando de 1:1000 em tampão de bloqueio em 150-200 μL / lâmina) e incube por 1 h a 37 ° C. Em seguida, lave com PBS / Triton X-100, três vezes (5-10 min cada).</li>
	<li>Aplique uma gota de meio de montagem DAPI para rotular os núcleos antes de cobrir a lâmina com uma lamínula. Evite bolhas de ar ao colocar a lamínula.</li>
	<li>Use um microscópio fluorescente para verificar a lâmina e capturar imagens (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: As células estão localizadas com DAPI em ex/em 359/461 com ampliação de 10x para localizar células; maior ampliação pode capturar células. Outros comprimentos de onda dependeriam da cor escolhida. Cor verde (GFP) - ex/em 488/510. Cor vermelha (Cy3) - ex / em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relevantes para o conteúdo deste artigo.

O isolamento do epitélio pigmentado primário da retina (EPR) de camundongos foi previamente documentado por nosso laboratório. Este manuscrito descreve um protocolo de demonstração detalhado para o isolamento primário de células de Müller. Este procedimento envolve enucleação, tratamento, dissecação, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células de Müller isoladas de olhos de camundongos. Baseia-se em um protocolo previamente bem-sucedido encontrado em publicações anteriores e em nosso protocol...

As células de Müller (MCs) são as principais e mais abundantes células gliais encontradas no tecido retiniano. Eles são os principais atores no fornecimento de integridade estrutural e funções metabólicas dentro da retina1. A estrutura estratégica dos MCs está espalhada por toda a espessura da retina, fornecendo suporte à retina. Além de suas propriedades semelhantes a andaimes, eles têm funções metabólicas para os neurônios da retina, fornecendo-lhes substratos energéticos, incluindo glicose e lactato. Essas funções são cruciais para manter a função neuronal saudável. Foi relatado que MCs prejudicados contribuem para várias doenças da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética e glaucoma 2,3. Os MCs podem ser fontes celulares endógenas para terapia regenerativa na retina1. Eles também compreendem uma porção significativa da retina, e fortes evidências sugerem que, em várias espécies, essas células podem ser estimuladas a substituir os neurônios ausentes2. Eles colaboram beneficamente com os neurônios, e os pés finais das células de Müller com ramificações cônicas desembainham densamente os vasos sanguíneos e conectam os componentes neurais da retina. Para manter o desenvolvimento neuronal e a plasticidade neuronal, as células de Müller atuam como um substrato macio para os neurônios, protegendo-os de traumas mecânicos3. Além disso, em circunstâncias patológicas, as células de Müller podem se diferenciar em progenitores neurais ou células-tronco que replicam ou regeneram os fotorreceptores e neurônios perdidos 2,3,4. As células de Müller mantêm as características das células-tronco da retina, incluindo diferentes níveis de potencial de auto-renovação e diferenciação 5,6. A célula glial de Müller tem uma linhagem retiniana significativa que produz fatores neurotróficos, capta e recicla neurotransmissores, tampona espacialmente os íons e mantém a barreira hemato-retiniana para manter a retina em homeostase 7,8,9. Isso destaca o potencial das células de Müller como uma ferramenta promissora em terapias baseadas em células para o tratamento de doenças relacionadas à degeneração da retina. As células de Müller são a glia primária distribuída por toda a retina, conectando-se a neurônios e vasos sanguíneos. Eles desempenham um papel protetor crucial, fornecendo suporte estrutural e metabólico essencial para manter a viabilidade e estabilidade das células da retina. Infelizmente, muito poucos protocolos são encontrados na literatura para isolamento primário de células de Müller da retina10,11.
Apresentamos uma abordagem aprimorada para isolar e cultivar de forma confiável células primárias de Müller de camundongo. Este protocolo foi usado em nosso grupo para isolar células de Müller de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem e camundongos transgênicos12,13. Camundongos com idade entre 5 e 11 dias, sem preferência sexual, são utilizados para este protocolo. As células foram passadas até 4 vezes; no entanto, em P4 eles param de aderir ao frasco e torna-se difícil cultivar uma cultura saudável. A cultura é frequentemente contaminada com células epiteliais pigmentadas da retina (RPE), portanto, as células devem ser passadas pelo menos uma vez antes de realizar qualquer experimento adicional na linha celular. A passagem permite um maior isolamento de contaminantes. Portanto, o protocolo apresentado oferece uma maneira rápida e eficaz de isolar células de Müller de camundongos, que podem ser usadas como uma plataforma confiável para pesquisar alvos terapêuticos e avaliar possíveis tratamentos para doenças da retina14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

A principal célula de suporte da retina é a célula glial de Müller da retina. Eles cobrem toda a superfície da retina e estão próximos dos vasos sanguíneos da retina e dos neurônios da retina. Devido ao seu crescimento, as células de Müller realizam várias tarefas cruciais em uma retina saudável, incluindo a captação e reciclagem de neurotransmissores, compostos de ácido retinóico e íons (como potássio K + ). Além de regular o fluxo sanguíneo e manter a barreira hemato-retiniana, eles também regulam o metabolismo e o fornecimento de nutrientes para a retina. Um procedimento estabelecido para isolar células primárias de Müller de camundongo é apresentado neste manuscrito. Para entender melhor os processos moleculares subjacentes envolvidos nos vários modelos de camundongos de distúrbios oculares, o isolamento de células de Müller é uma excelente abordagem. Este manuscrito descreve um procedimento detalhado para o isolamento de células de Müller de camundongos. Da enucleação à semeadura, todo o processo dura cerca de algumas horas. Por 5-7 dias após a semeadura, o meio não deve ser alterado para permitir que as células isoladas cresçam sem impedimentos. A caracterização celular usando morfologia e marcadores imunofluorescentes distintos vem a seguir no processo. As passagens máximas para as células são de 3 a 4 vezes.

Validação da especificidade, pureza e função de barreira de células de Müller isoladas Para confirmar a viabilidade, morfologia e qualidades distintivas das células de Müller isoladas, as células foram examinadas ao microscópio óptico. As imagens P0 e P1 foram registradas (Figura 1A). Para verificar a contaminação das células de Müller isoladas com células RPE e confirmar sua pureza, a coloração por imunofluorescência (IF) foi realizada usando anticorpo...

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

776 visualizações.  Oakland University. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.