La mayoría de los experimentos estudian las interacciones entre plantas y microbios centrándose en la colonización, pero nuestro protocolo está diseñado para examinar tanto la colonización como el mantenimiento de las bacterias en la raíz. Podemos cambiar el experimento para adaptarse a diferentes bacterias y plantas, e incluso podemos probar múltiples bacterias en cada placa de 24 pozos. Para empezar, utilice un perforador de agujero estándar para crear discos de malla de plástico.
Recoja los discos en un recipiente de vidrio y cúbralo libremente. Esterilice utilizando un autoclave en un ciclo seco de 20 minutos. Utilice pinzas esterilizadas con llama para distribuir aproximadamente 40 discos de malla esterilizados en una sola capa a través de la superficie de la placa de agar medio de crecimiento vegetal previamente preparada.
Coloque dos semillas previamente esterilizadas en el centro de cada malla. Selle la placa con cinta quirúrgica e incubar durante dos a seis días a cuatro grados Celsius en la oscuridad para vernalizar las semillas. A continuación, coloque el agar-lado de la placa hacia abajo en una cámara de crecimiento de la planta durante ocho a 10 días bajo escenarios de día corto de nueve horas de luz a 21 grados Celsius y 15 horas de oscuridad a 18 grados Celsius para germinar y crecer plántulas.
Añadir un mililitro de medio de crecimiento bacteriano a cada pozo de una placa estéril de 24 pozos. Para transferir las plántulas germinadas incrustadas en malla, utilice fórceps esterilizados con llama para pelar suavemente la malla que contiene dos plántulas germinadas, de igual tamaño y sin daños hacia arriba y fuera de la placa de agar. Transfiera un flotador con plántulas a cada pozo de líquido de crecimiento bacteriano, de raíz hacia abajo.
A continuación, las bacterias resuspend cultivadas durante la noche en placas de agar en medio de crecimiento bacteriano líquido. Añadir 10 microlitros de suspensión bacteriana a cada pozo, excepto para pozos de control sólo de medios, para una concentración final de un millón de unidades formadoras de colonias de bacterias por pozo. Para sellar la placa para un crecimiento estéril, presione cuidadosamente la película permeable al gas a través de la placa sin tocar el lado pegajoso.
Aplique presión alrededor de cada uno de los anillos hechos por los pozos para asegurarse de que cada pozo ha sido sellado individualmente. A continuación, cierre la placa con su tapa de plástico acurrucó sobre la película permeable al gas. Coloque la placa en una cámara de crecimiento de la planta en un agitador de placa orbital establecido en 220 rpm, e incubar durante 18 horas en las mismas condiciones en que las plántulas fueron germinadas originalmente.
Para enjuagar todos los flotadores con plantas, agregue un mililitro de agua estéril a cada pozo de una nueva placa de 24 pozos. Retire la película permeable al gas de la placa con plantas, y utilice fórceps estériles para transferir flotadores a pozos con agua, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. A continuación, llene cada pozo de una nueva placa de 24 pozos con un mililitro de medio de crecimiento de la planta.
Transfiera una malla a cada pozo y cúbralo con un sello permeable al gas. Incubar durante 72 horas en el agitador de placa orbital a 220 rpm en la cámara de crecimiento de la planta. Después de la incubación, enjuague las plantas como se ha hecho anteriormente.
Después del enjuague, retire las plántulas de la malla colocando suavemente los fórceps esterilizados con llama debajo de las hojas en el lado de la hoja de la malla. Pellizque ligeramente el tallo, y mueva las plántulas hacia arriba y lejos de la malla para desalojar la raíz sin romperla. Para eliminar las bacterias de las raíces de las plantas, transfiera las plántulas de cada malla a pozos individuales de una placa de sonicación de 24 pozos que contenga un mililitro de agua de doble destilación.
Sonicar todas las muestras dentro de la placa a la vez utilizando un sonicador multipropósido como se describe en el manuscrito. Para cuantificar las bacterias, realice diluciones seriales de 10 veces de las muestras sonicadas en medio de crecimiento bacteriano. Esparce con cuentas de vidrio estériles e incubar a la temperatura óptima para las bacterias hasta que las colonias individuales sean contadas.
Para recoger la raíz de la planta intacta, utilice fórceps para eliminar las plántulas de la malla. A continuación, transfiera cada planta a un portaobjetos de microscopio colocando la punta de la raíz en la diapositiva y arrastrándola lejos de la punta para ajustar el derribo al ras con la diapositiva, asegurando una raíz enderezada para obtener la mejor imagen. Agregue una gota de agua o medio de crecimiento estéril de la planta a cada muestra para hidratar las interfaces entre los cubreobjetos y los portaobjetos.
Coloque un cubreobjetos de vidrio justo encima de la corona de la raíz y por debajo de las hojas de la brote para evitar inclinarse del cubreobjetos, y presione suavemente hacia abajo. A continuación, imagine las bacterias utilizando filtros de excitación/emisión adecuados para diferenciar las bacterias entre sí y la raíz de la planta. Pseudomonas simiae, bacteria naturalmente fluorescente, raíces Arabidopsis thaliana colonizadas y se mantuvo en la raíz después de la transferencia al medio de crecimiento de la planta.
La corona de raíz, la longitud media y la punta muestran fluorescencia debido a la colonización de Pseudomonas simiae. El control negativo sin bacterias no mostró ninguna colonización. Cuando Pseudomonas simiae en raíces arabidopsis thaliana se cuantificó después de 18 horas de colonización o 72 horas de mantenimiento, el número total de unidades formadoras de colonias per plántula en cualquier momento mostró una buena reproducibilidad a través de réplicas biológicas realizadas en días diferentes.
Hubo un aumento en el número de unidades formadoras de colonias por plántula después de 72 horas en medio de mantenimiento, en comparación con los números observados en el punto de tiempo posterior a la colonización de 18 horas, lo que indica que el crecimiento activo de las bacterias colonizadas en la raíz de la planta se produjo durante la etapa de mantenimiento. Tres especies de bacterias aisladas de Arabidopsis thaliana cultivadas en suelos naturales en condiciones de laboratorio se utilizaron para monitorear la asociación de múltiples especies en raíces vegetales. Se diferenciaron claramente en los medios que contenían X-gal debido a las diferencias en la morfología y el color de las colonias, lo que permitió contar las unidades formadoras de colonias por plántula de cada especie sin selección de antibióticos, incluso en la cocultura multiespecie.
Estas tres especies de bacterias fueron colonizadas y mantenidas en la raíz, ya sea solas o en cocultura bacteriana. Cada especie mostró tendencias similares en diferentes réplicas biológicas y técnicas, mostrando que este protocolo se puede utilizar para medir unidades relativas o totales formadoras de colonias por raíz de cada especie. Cuando se cultiva solo, ninguna especie individual mostró un aumento sustancial en la abundancia durante la etapa de mantenimiento, pero las unidades formadoras de colonias generales por raíz de la comunidad combinada aumentaron en coculturas, lo que indica que estas bacterias no prohíben la colonización de las otras cepas.
Los pasos más difíciles son aquellos que requieren la eliminación de plantas intactas de los discos de malla. Ser paciente y gentil hará que esto sea posible. Si las células bacterianas son fluorescentes, las muestras podrían ordenarse por citometría de flujo para determinar el número relativo de células.
