Nuestra investigación se centra en analizar el desarrollo de fibrosis en el rechazo crónico del aloinjerto pulmonar. Por lo tanto, estamos interesados en métodos que caractericen el compartimento de tejido fibrótico. Para reproducir las enfermedades relacionadas con el trasplante, empleamos el modelo de ratón de trasplante de pulmón único que introdujimos hace varios años.
En este modelo, se ha demostrado que el trasplante de un pulmón entre cepas alogénicas de ratón da lugar a diferentes niveles de fibrosis del injerto. Los datos histológicos sobre la remodelación del tejido fibrótico a menudo se presentan de manera cualitativa. Nuestro método de tinción Picrosirius Red ofrece la ventaja de una evaluación semicuantitativa y diferencia entre fibras de colágeno gruesas y finas.
Para comenzar, hidrate las muestras de pulmón de ratón incluidas en parafina en concentraciones decrecientes de etanol durante dos minutos cada una. Tiñe el portaobjetos durante ocho minutos con la solución de hemalum de Meyer. Lave el portaobjetos durante 10 minutos con agua corriente del grifo, luego incube el portaobjetos durante una hora en la solución Picrosirius Red.
Sumerja el portaobjetos de cinco a 10 veces en una solución de ácido acético al 0,5%. Agite suavemente el portaobjetos para extraer la solución. Ahora deshidrate el portaobjetos en concentraciones crecientes de etanol y 100% de xilol durante cinco minutos cada uno.
Agregue una gota de medio de montaje sobre la muestra para incrustar y cúbrala con un cubreobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen bajo una campana extractora. Bajo un microscopio óptico, utilice un software de imagen adecuado para enfocar la muestra hasta obtener una imagen clara y nítida.
Ajuste el grado del filtro de polarización hasta que el fondo esté completamente oscuro o negro. Escanee la muestra con un aumento de 20x y exporte las imágenes en formato TIFF. Transfiera las imágenes al software Fiji.
Haga clic en Editar y seleccione Borrar exterior. A continuación, haga clic en Analizar seguido de Medir para medir el área de superficie total. Para medir el contenido total de colágeno por muestra, haga clic en Imagen seguido de Ajustar y Umbral de color.
Establezca el tono entre 2 y 130 y el brillo entre 35 y 255. A continuación, haga clic en Analizar y, en la ventana Analizar partículas, establezca el tamaño en 1 menos infinito y marque las casillas Borrar y Resumir. Ajuste el tono a rojo para el análisis de fibras de colágeno gruesas y verde amarillo para fibras de colágeno delgadas, y mida el recuento total de colágeno.
Por último, haga clic en Plugins, Macros y Record para configurar la macro para el procesamiento automatizado. La tinción tricrómica de Masson, Herovici y rojo de Picrosirius ilustró una extensa deposición de colágeno parabronquial y paravascular en el modelo desajustado del complejo de histocompatibilidad principal. El modelo de desajuste menor mostró principalmente infiltrados linfocitarios densos con depósito de colágeno menos intenso.
La tinción de Picrosirius Red con un filtro de polarización reveló una apariencia verde de las fibras depositadas en ambos modelos. Los controles con isoinjertos mostraron colágeno restringido a los bordes parabronquiales y paravasculares, similar a los pulmones murinos naïve. El análisis de imágenes digitales reveló un aumento del colágeno total en los injertos pulmonares no coincidentes del complejo de histocompatibilidad mayor en comparación con los injertos incompatibles menores, el tejido pulmonar naïve del lado derecho o los pulmones izquierdos con BALB/c naïve.
No se demostraron diferencias en las fibras gruesas de colágeno. El análisis de las fibras finas de colágeno mostró una mayor presencia en el modelo de incompatibilidad mayor en comparación con el modelo de incompatibilidad menor, el tejido pulmonar del lado derecho previo o los pulmones izquierdos BALB/c previos.
