La fibrosis tisular es la forma principal en que los órganos fallan con el tiempo, en respuesta a la inflamación crónica o al envejecimiento. Y de hecho, yo diría que si no mueres de un agente infeccioso o cáncer, es probable que mueras de fibrosis de órganos a medida que envejeces. Desafortunadamente, no hay muchos grandes modelos de ratón para imitar la fibrosis de tejido humano.
Así que lo que hemos desarrollado es un modelo de ratón de la enfermedad de Crohn, que es una enfermedad en humanos que causa fibrosis intestinal y es en gran parte intratable. De hecho, la única manera de tratarlo es a través de la extirpación quirúrgica del tejido fibroso y la re-ligación del intestino. La ventaja de nuestro modelo es que es totalmente penetrante en todas las cepas de ratón y imita muy de cerca la enfermedad humana de Crohn y la fibrosis persiste durante más de un mes, que es realmente un modelo robusto.
La parte más difícil de este procedimiento es el manejo de los ratones y especialmente el gavage oral ya que eso requiere una gran cantidad de práctica certificación especial. Al realizar este procedimiento por primera vez, uno debe ser consciente de que trabajar con Salmonella requiere las precauciones de seguridad adecuadas y la técnica estéril. La eliminación de residuos y bacterias debe planificarse antes del experimento.
La demostración visual de este procedimiento es muy importante porque implica el manejo de Salmonella que requiere precauciones especiales de seguridad, así como una adecuada técnica estéril. Para comenzar este procedimiento, establezca una placa con agar LB que contenga estreptomicina a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Usando un bucle de inoculación estéril, raya la placa con un stock de glicerol congelado de S typhimurium flecha delta a.
Incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Las placas de rayas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Un día antes de la infección, disolver 0,5 gramos de estreptomicina en 2,5 mililitros de agua para preparar el antibiótico.
Filtrar esterilizar la solución de estreptomicina. A continuación, utilice una aguja de gavage de calibre 22 con punta de bombilla con una jeringa de un mililitro para evaluar por vía oral a los ratones con 100 microlitros de la solución de estreptomicina. A continuación, agregue tres mililitros de caldo de LB que contenga estreptomicina a una concentración de 50 microgramos por mililitro a un tubo de cultivo.
Usando un bucle de inoculación, inocular el caldo LB con una sola colonia. Incubar el cultivo aeróbicamente durante la noche a 37 grados centígrados con temblores a 200 rpm. El día de la infección, realice dos diluciones consecutivas de una a 10 diluciones de los cultivos nocturnos de Salmonella con PBS estéril para preparar la dosis final de infección.
Esto da como resultado un inóculo de 100 microlitros que contiene aproximadamente tres millones de unidades formadoras de colonias. Después de esto, utilice una aguja gavage de calibre 22 con punta de bombilla con una jeringa de mililitro para gavage cada ratón con 100 microlitros de la Salmonella preparada. En primer lugar, establezca dos microtubos de fondo redondo de bloqueo seguro de mililitro, agregue un mililitro de PBS estéril y un cordón de acero inoxidable autoclavado a cada tubo.
Prepesee los tubos antes de la recolección del tejido. Después de eutanasiar ratones, resecar sus tejidos cecales y esplénicos, asegurándose de recoger tejido de animales individuales en tubos separados. Pesar cada tubo para determinar los pesos tisulares.
Utilice un aparato de molino mezclador para homogeneizar los tejidos a 30 hercios durante 15 minutos. A continuación, transfiera 900 microlitros de PBS a cada pozo de un megabloque de 96 pozos de dos mililitros. Pipetear 100 microlitros de tejido homogeneiza en el primer pozo, y mezclar bien.
Realice diluciones en serie añadiendo 100 microlitros a pozos posteriores, hasta obtener una sexta dilución de 10 a la negativa sexta. Placa 10 microlitros de cada dilución en triplicados sobre agar LB que contiene estreptomicina. A continuación, cuente las unidades formadoras de colonias promedio y determine las unidades formadoras de colonias por gramo de tejido como se describe en el protocolo de texto.
Open Fiji, que es un software de imágenes de código abierto y arrastrar y soltar el archivo de imagen tif en la barra de herramientas. En la barra de menús, seleccione Imagen, Tipo, pila RGB para dividir la imagen en canales rojos, verdes y azules. Deslice la barra horizontal en la parte inferior del panel para establecer el canal en verde.
Abra la herramienta Imagen, Ajustar, Umbral. Ajuste los límites mínimo y máximo para eliminar las señales de fondo. Una vez establecido el umbral deseado, cierre la herramienta de umbral y vaya a Analizar, Establecer medidas, marcar el área, Fracción de área, Límite al umbral y Mostrar etiqueta.
Obtenga la selección de tejido con la herramienta selecciones a mano alzada o selecciones de polígonos y mida el área de porcentaje positiva para el colágeno haciendo clic en Analizar, Medir. A continuación, normalice el área absoluta positiva para la tinción de colágeno en el área del tejido. El tratamiento con estreptomicina seguido de una infección oral con la flecha S typhimurium delta a conduce a una inflamación intestinal robusta y fibrosis, especialmente en el cecum.
Las cargas típicas de patógenos de 100 millones a mil millones de unidades formadoras de colonias se pueden recuperar por gramo de cecum de animales infectados, mientras que 10 mil unidades formadoras de colonias normalmente se pueden recuperar por gramo de bazo. La evaluación de la fibrosis en las secciones cecales teñidas de rojo picrosirius indica fibrosis máxima 21 días después de la infección, mientras que gran parte de la patología se resuelve en el día 42 después de la infección. La preparación exhaustiva de los materiales es esencial, ya que este experimento requiere varios días para configurarlos.
La preparación de las placas LB y Salmonella y Streptomicina deben realizarse asépticamente. Antes del experimento, asegúrese de que el experimentador esté familiarizado con el protocolo animal, así como con los peligros de seguridad. Al evaluar la carga de colágeno, el experimentador puede optar por realizar otros ensayos biológicos, como la secuenciación de ARN para evaluar los perfiles de expresión génica o la citometría de flujo para evaluar subconjuntos de células inmunitarias o un tejido ELISA para evaluar los perfiles de citoquinas.
Así que nuestro modelo es particularmente bueno para imitar una enfermedad humana llamada enfermedad de Crohn donde se obtiene fibrosis del intestino, que es en gran parte intratable y la única manera de tratarlo es quitar una sección del intestino y coserlo de nuevo y esperar que no vuelva. Nuestro modelo es muy robusto y ya hemos demostrado que apuntar a las células linfoides innatas tipo tres, un factor de transcripción llamado alfa crudo, o interleucina 17 mejora la enfermedad y previene la fibrosis. Nuestro modelo es particularmente bueno para identificar los factores que juegan en la patogénesis de la enfermedad de Crohn y la fibrosis intestinal y ya estamos en el camino para identificar una serie de dianas que podrían ser tratadas terapéuticamente para aliviar la enfermedad inflamatoria intestinal.
Nuestro modelo ya ha entrado en el mismo acceso ILC3 o alfa NIL17 puede estar en juego en otras enfermedades fibrosas y estos incluyen cosas como psoriasis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar idiopática. Así que es posible que la orientación de estos mismos factores podría aliviar la fibrosis en esas enfermedades también. Aunque el flujo mutante de Salmonella no es virulento, es importante seguir los protocolos de seguridad de riesgo biológico estándar dados por la instalación.
Además, dado que se sabe que los vapores de formaldehído son cancerígenos, es importante trabajar detrás de una campana de humo durante el paso de fijación.
