La nostra ricerca si concentra sull'analisi dello sviluppo della fibrosi nel rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare. Siamo quindi interessati a metodi che caratterizzano il compartimento del tessuto fibrotico. Per riprodurre le malattie correlate al trapianto, impieghiamo il modello murino di trapianto di polmone singolo che abbiamo introdotto diversi anni fa.
In questo modello, è stato dimostrato che il trapianto di un polmone tra ceppi di topo allogenico provoca diversi livelli di fibrosi del trapianto. I dati istologici sul rimodellamento del tessuto fibrotico sono spesso presentati qualitativamente. Il nostro metodo che utilizza la colorazione con Picrosirius Red offre il vantaggio di una valutazione semiquantitativa e distingue tra fibre di collagene spesse e sottili.
Per iniziare, idratare i campioni di polmone di topo inclusi in paraffina in concentrazioni decrescenti di etanolo per due minuti ciascuno. Colorare il vetrino per otto minuti nella soluzione di emalum di Meyer. Lavare il vetrino per 10 minuti sotto l'acqua corrente del rubinetto, quindi incubare il vetrino per un'ora nella soluzione di Picrosirius Red.
Immergere il vetrino da cinque a 10 volte in una soluzione di acido acetico allo 0,5%. Scuotere delicatamente il vetrino per rimuovere la soluzione. Ora disidratare il vetrino aumentando le concentrazioni di etanolo e xilolo al 100% per cinque minuti ciascuno.
Aggiungere una goccia di terreno di montaggio sul campione per l'inclusione e coprire con un vetrino coprioggetto. Lasciare asciugare i vetrini sotto una cappa aspirante. Al microscopio ottico, utilizzare un software di imaging appropriato per mettere a fuoco il campione fino a ottenere un'immagine chiara e nitida.
Regola il grado del filtro di polarizzazione fino a quando lo sfondo non è completamente scuro o nero. Scansiona il campione con un ingrandimento di 20x ed esporta le immagini in formato TIFF. Trasferisci le immagini al software Fiji.
Fate clic su Modifica (Edit) e selezionate Cancella esterno (Clear Outside). Quindi fare clic su Analizza seguito da Misura per misurare la superficie totale. Per misurare il contenuto totale di collagene per campione, fare clic su Immagine e quindi su Regola e Soglia colore.
Impostare la tonalità tra 2 e 130 e la luminosità tra 35 e 255. Quindi fare clic su Analizza e, nella finestra Analizza particelle, impostare la dimensione su 1 meno infinito e selezionare le caselle Cancella e Riepiloga. Regolare la tonalità in rosso per l'analisi delle fibre di collagene spesse e in giallo verde per le fibre di collagene sottili e misurare la conta totale del collagene.
Infine, fai clic su Plugin, macro e record per configurare la macro per l'elaborazione automatizzata. La colorazione tricromica di Masson, il rosso di Herovici e il rosso di Picrosirius hanno illustrato un'estesa deposizione di collagene parabronchiale e paravascolare nel modello non corrispondente del complesso maggiore di istocompatibilità. Il modello minore non corrispondente mostrava principalmente infiltrati linfocitici densi con deposizione di collagene meno intensa.
La colorazione Picrosirius Red con un filtro di polarizzazione ha rivelato un aspetto verde delle fibre depositate in entrambi i modelli. I controlli con isotrapianto hanno mostrato che il collagene era limitato ai bordi parabronchiali e paravascolari, in modo simile ai polmoni murini naïve. L'analisi delle immagini digitali ha rivelato un aumento del collagene totale negli innesti polmonari non corrispondenti del complesso maggiore di istocompatibilità rispetto agli innesti non corrispondenti minori, al tessuto polmonare naïve destro o ai polmoni sinistri BALB/c naïve.
Non sono state dimostrate differenze nelle fibre spesse di collagene. L'analisi delle fibre sottili di collagene ha mostrato una maggiore presenza nel modello principale non corrispondente rispetto al modello minore non corrispondente, al tessuto polmonare destro naïve o ai polmoni sinistri BALB/c naïve.
