Наше исследование сосредоточено на анализе развития фиброза при хроническом отторжении аллотрансплантата легкого. Поэтому нас интересуют методы, которые характеризуют фиброзный тканевый компартмент. Для воспроизведения заболеваний, связанных с трансплантацией, мы используем мышиную модель трансплантации одного легкого, которую мы представили несколько лет назад.
В этой модели было показано, что трансплантация легкого между аллогенными линиями мышей приводит к различным уровням фиброза трансплантата. Гистологические данные по ремоделированию фиброзной ткани часто представлены качественно. Наш метод окрашивания Picrosirius Red дает преимущество полуколичественной оценки и позволяет дифференцировать толстые и тонкие коллагеновые волокна.
Для начала увлажните образцы легких мыши, содержащие парафин, в уменьшающейся концентрации этанола в течение двух минут каждый. Окрасьте предметное стекло на восемь минут в раствор гемалума Мейера. Промойте предметное стекло в течение 10 минут под проточной водой из-под крана, затем выдержите предметное стекло в течение одного часа в растворе Picrosirius Red.
Опустите предметное стекло от пяти до 10 раз в 0,5% раствор уксусной кислоты. Осторожно встряхните предметное стекло, чтобы удалить раствор. Теперь обезвожьте предметное стекло в возрастающей концентрации этанола и 100% ксилола в течение пяти минут каждого.
Добавьте одну каплю монтажного носителя на образец для встраивания и накройте крышкой. Дайте предметным стеклам высохнуть под вытяжным шкафом. Под световым микроскопом используйте соответствующее программное обеспечение для фокусировки образца до тех пор, пока не будет получено четкое и четкое изображение.
Регулируйте степень поляризационного фильтра до тех пор, пока фон не станет полностью темным или черным. Отсканируйте образец с 20-кратным увеличением и экспортируйте изображения в формат TIFF. Перенесите изображения в программное обеспечение Fiji.
Нажмите кнопку Редактировать и выберите Очистить снаружи. Затем нажмите «Анализировать», а затем «Измерить», чтобы измерить общую площадь поверхности. Чтобы измерить общее содержание коллагена в образце, нажмите «Изображение», а затем «Настройка» и «Порог цвета».
Установите оттенок от 2 до 130 и яркость от 35 до 255. Затем нажмите «Анализ» и в окне «Анализ частиц» установите размер на 1 минус бесконечность и отметьте галочками поля «Очистить» и «Суммировать». Отрегулируйте оттенок на красный для анализа толстых коллагеновых волокон и желтый зеленый для тонких коллагеновых волокон, а также измерьте общее количество коллагена.
Наконец, нажмите «Подключаемые модули», «Макросы» и «Запись», чтобы настроить макрос для автоматической обработки. Окрашивание по трихрому Массона, Херовичи и Picrosirius Red проиллюстрировало обширное отложение парабронхиального и параваскулярного коллагена в несогласованной модели основного комплекса гистосовместимости. Незначительная несогласованная модель в первую очередь показала плотные лимфоцитарные инфильтраты с менее интенсивным отложением коллагена.
Окрашивание Picrosirius Red с помощью поляризационного фильтра показало зеленый вид отложенных волокон на обеих моделях. Контроль изотрансплантата показал, что коллаген ограничен парабронхиальными и параваскулярными границами, подобно наивным мышиным легким. Анализ цифровых изображений выявил повышенное содержание общего коллагена в несоответствующих трансплантатах большого комплекса гистосовместимости по сравнению с незначительными несовпадающими трансплантатами, правосторонней наивной легочной тканью или наивными левыми легкими BALB/c.
Различий в толстых коллагеновых волокнах не выявлено. Анализ тонких коллагеновых волокон показал повышенное присутствие в основной несоответствующей модели по сравнению с незначительной несоответствующей моделью, наивной правосторонней легочной тканью или наивной левой легкой BALB/c.