Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft rejection(만성 폐 동종이식 거부 반응의 쥐 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 조직병리학적 평가를 위한 Picrosirius Red Staining)

본 연구는 만성 폐 동종이식 거부반응에서 섬유증의 발생을 분석하는 데 중점을 두고 있습니다. 따라서 우리는 섬유성 조직 구획을 특성화하는 방법에 관심이 있습니다. 이식 관련 질병을 재현하기 위해 우리는 몇 년 전에 도입한 단일 폐 이식의 마우스 모델을 사용합니다.

이 모델에서는 동종 마우스 균주 사이의 폐 이식이 다양한 수준의 이식 섬유화를 초래하는 것으로 나타났습니다. 섬유성 조직 리모델링에 대한 조직학 데이터는 종종 정성적으로 제시됩니다. Picrosirius Red 염색을 사용하는 당사의 방법은 반정량 평가의 이점을 제공하며 두꺼운 콜라겐 섬유와 얇은 콜라겐 섬유를 구별합니다.

먼저 파라핀이 함유된 마우스 폐 샘플을 각각 2분씩 감소시키는 에탄올 농도로 수화합니다. Meyer의 헤말럼 용액에 슬라이드를 8분 동안 염색합니다. 흐르는 수돗물에 슬라이드를 10분 동안 세척한 다음 Picrosirius Red 용액에서 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다.

슬라이드를 0.5% 아세트산 용액에 5-10회 담급니다. 슬라이드를 부드럽게 흔들어 용액을 제거합니다. 이제 에탄올 농도와 100% 자일롤을 각각 5분 동안 증가시키는 슬라이드를 탈수합니다.

삽입을 위해 샘플에 장착 매체 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다. 흄 후드 아래에서 슬라이드를 건조시키십시오. 광학 현미경 아래에서 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 선명하고 선명한 이미지를 얻을 때까지 샘플의 초점을 맞춥니다.

배경이 완전히 어둡거나 검게 될 때까지 편광 필터의 정도를 조정합니다. 20배 배율로 샘플을 스캔하고 이미지를 TIFF 형식으로 내보냅니다. 이미지를 피지 소프트웨어로 전송합니다.

편집을 클릭하고 외부 지우기를 선택합니다. 그런 다음 Analyze(분석)를 클릭한 다음 Measure(측정)를 클릭하여 총 표면적을 측정합니다. 샘플당 총 콜라겐 함량을 측정하려면 Image(이미지)를 클릭한 다음 Adjust and Color Threshold(조정 및 색상 임계값)를 클릭합니다.

색조를 2에서 130 사이로, 밝기를 35에서 255 사이로 설정합니다. 그런 다음 Analyze(분석)를 클릭하고 Analyze Particles(파티클 분석) 창에서 크기를 1 빼기 무한대로 설정하고 Clear(지우기) 및 Summarize(요약) 상자를 선택합니다. 두꺼운 콜라겐 섬유를 분석하려면 색조를 빨간색으로 조정하고 얇은 콜라겐 섬유를 분석하려면 황록색으로 조정하고 총 콜라겐 수를 측정합니다.

마지막으로 Plugins(플러그인), Macros(매크로) 및 Record(기록)를 클릭하여 자동화된 처리를 위해 매크로를 구성합니다. Masson의 trichrome, Herovici's 및 Picrosirius Red 염색은 주요 조직적합성 복합체 불일치 모델에서 광범위한 기관지 및 혈관 주위 콜라겐 침착을 보여주었습니다. 경미한 불일치 모델은 주로 덜 강렬한 콜라겐 침착과 함께 밀집된 림프구 침윤을 보여주었습니다.

편광 필터로 Picrosirius Red 염색을 하면 두 모델 모두에서 침전된 섬유의 녹색 모양이 드러났습니다. 동위 이식 대조군은 콜라겐이 순진한 쥐의 폐와 유사하게 기관지 주위 및 혈관 주위 경계에 국한되어 있음을 보여주었습니다. 디지털 이미지 분석은 경미한 불일치 이식편, 우측 미접촉 폐 조직 또는 나이브 BALB/c 좌측 폐에 비해 주요 조직적합성 복합체 불일치 폐 이식편에서 총 콜라겐이 증가한 것으로 나타났습니다.

두꺼운 콜라겐 섬유에서는 차이가 나타나지 않았다. 얇은 콜라겐 섬유를 분석한 결과, 경미한 불일치 모델, 즉 미성숙한 우측 폐 조직 또는 미성숙한 BALB/c 좌측 폐에 비해 주요 미스매치 모델에서 존재감이 증가한 것으로 나타났습니다.