Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire

Notre recherche porte sur l’analyse du développement de la fibrose dans le rejet chronique d’une allogreffe pulmonaire. Nous nous intéressons donc aux méthodes qui caractérisent le compartiment du tissu fibreux. Pour reproduire les maladies liées à la transplantation, nous utilisons le modèle murin de transplantation d’un seul poumon que nous avons introduit il y a plusieurs années.

Dans ce modèle, il a été démontré que la transplantation d’un poumon entre des souches de souris allogéniques entraîne différents niveaux de fibrose du greffon. Les données histologiques sur le remodelage du tissu fibreux sont souvent présentées de manière qualitative. Notre méthode utilisant la coloration rouge Picrosirius offre l’avantage d’une évaluation semi-quantitative et différencie les fibres de collagène épaisses et fines.

Pour commencer, hydratez les échantillons de poumons de souris inclus dans de la paraffine en diminuant les concentrations d’éthanol pendant deux minutes chacun. Teintez la lame pendant huit minutes dans une solution d’hémalum de Meyer. Lavez la lame pendant 10 minutes sous l’eau courante du robinet, puis incubez la lame pendant une heure dans la solution Picrosirius Red.

Trempez la lame cinq à 10 fois dans une solution d’acide acétique à 0,5 %. Secouez doucement la lame pour retirer la solution. Maintenant, déshydratez la lame en augmentant les concentrations d’éthanol et de xylol à 100 % pendant cinq minutes chacune.

Ajoutez une goutte de milieu de montage sur l’échantillon pour l’enrobage et recouvrez d’une lamelle. Laissez les lames sécher sous une hotte. Au microscope optique, utilisez un logiciel d’imagerie approprié pour focaliser l’échantillon jusqu’à ce qu’une image claire et nette soit obtenue.

Ajustez le degré de polarisation du filtre jusqu’à ce que l’arrière-plan soit complètement sombre ou noir. Numérisez l’échantillon sous un grossissement de 20x et exportez les images au format TIFF. Transférez les images vers le logiciel Fidji.

Cliquez sur Modifier et sélectionnez Effacer l’extérieur. Cliquez ensuite sur Analyser puis sur Mesurer pour mesurer la surface totale. Pour mesurer la teneur totale en collagène par échantillon, cliquez sur Image, puis sur Ajuster et Seuil de couleur.

Réglez la teinte entre 2 et 130 et la luminosité entre 35 et 255. Cliquez ensuite sur Analyser et, dans la fenêtre Analyser les particules, définissez la taille sur 1 moins l’infini et cochez les cases Effacer et Résumer. Ajustez la teinte au rouge pour l’analyse des fibres de collagène épaisses et au jaune-vert pour les fibres de collagène minces, et mesurez le nombre total de collagène.

Enfin, cliquez sur Plugins, Macros et Enregistrer pour configurer la macro pour le traitement automatisé. Les colorations trichromes de Masson, d’Herovici et de Picrosirius Red ont illustré un dépôt important de collagène parabronchique et paravasculaire dans le modèle de désappariement du complexe majeur d’histocompatibilité. Le modèle mineur non apparié a principalement montré des infiltrats lymphocytaires denses avec un dépôt de collagène moins intense.

La coloration rouge Picrosirius avec un filtre polarisant a révélé un aspect vert des fibres déposées sur les deux modèles. Les contrôles d’isogreffe ont montré que le collagène était limité aux frontières parabronchiques et paravasculaires, comme les poumons murins naïfs. L’analyse d’images numériques a révélé une augmentation du collagène total dans les greffes pulmonaires non appariées du complexe majeur d’histocompatibilité par rapport aux greffons mineurs non appariés, au tissu pulmonaire naïf du côté droit ou aux poumons gauches BALB/c naïfs.

Aucune différence dans les fibres de collagène épaisses n’a été démontrée. L’analyse des fibres minces de collagène a montré une présence accrue dans le modèle majeur non apparié par rapport au modèle mineur non apparié, au tissu pulmonaire droit naïf ou aux poumons gauches BALB/c naïfs.