Nossa pesquisa se concentra em analisar o desenvolvimento de fibrose na rejeição crônica de aloenxertos pulmonares. Estamos, portanto, interessados em métodos que caracterizem o compartimento do tecido fibrótico. Para reproduzir doenças relacionadas ao transplante, empregamos o modelo de camundongo de transplante de pulmão único que introduzimos há vários anos.
Neste modelo, o transplante de um pulmão entre cepas alogênicas de camundongos demonstrou resultar em diferentes níveis de fibrose do enxerto. Os dados histológicos sobre a remodelação do tecido fibrótico são frequentemente apresentados qualitativamente. Nosso método usando a coloração Picrosirius Red oferece a vantagem de uma avaliação semiquantitativa e diferencia entre fibras colágenas grossas e finas.
Para começar, hidrate as amostras de pulmão de camundongo embebidas em parafina em concentrações decrescentes de etanol por dois minutos cada. Manchar a lâmina por oito minutos na solução de hemalum de Meyer. Lave a lâmina durante 10 minutos em água corrente da torneira e, em seguida, incube a lâmina durante uma hora em solução de Picrosirius Red.
Mergulhe a lâmina de cinco a 10 vezes em solução de ácido acético a 0,5%. Agite suavemente a lâmina para remover a solução. Agora desidrate a lâmina aumentando as concentrações de etanol e 100% de xilol por cinco minutos cada.
Adicione uma gota de meio de montagem na amostra para incorporação e cubra com uma lamínula. Deixe as corrediças secarem sob uma hotte. Sob um microscópio óptico, use o software de imagem apropriado para focar a amostra até que uma imagem clara e nítida seja obtida.
Ajuste o grau de filtro de polarização até que o fundo fique completamente escuro ou preto. Digitalize a amostra com ampliação de 20x e exporte as imagens no formato TIFF. Transfira as imagens para o software Fiji.
Clique em Editar e selecione Limpar Fora. Em seguida, clique em Analisar seguido de Medir para medir a área total da superfície. Para medir o conteúdo total de colágeno por amostra, clique em Imagem seguido de Ajustar e Limite de cor.
Defina a tonalidade entre 2 e 130 e o brilho entre 35 e 255. Em seguida, clique em Analisar e, na janela Analisar partículas, defina o tamanho como 1 menos infinito e marque as caixas Limpar e Resumir. Ajuste a tonalidade para vermelho para a análise de fibras de colágeno grossas e verde amarelo para fibras de colágeno finas e meça a contagem total de colágeno.
Por fim, clique em Plug-ins, Macros e Registro para configurar a macro para processamento automatizado. A coloração tricrômica de Masson, Herovici e Picrosirius Red ilustrou extensa deposição de colágeno parabrônquico e paravascular no modelo principal de incompatibilidade do complexo histocompatível. O modelo menor incompatível mostrou principalmente infiltrados linfocíticos densos com deposição de colágeno menos intensa.
A coloração Picrosirius Red com filtro de polarização revelou uma aparência verde das fibras depositadas em ambos os modelos. Os controles do isoenxerto mostraram colágeno restrito às bordas parabrônquicas e paravasculares, semelhante aos pulmões murinos virgens. A análise de imagem digital revelou aumento do colágeno total em enxertos pulmonares incompatíveis do complexo de histocompatibilidade maior em comparação com enxertos incompatíveis menores, tecido pulmonar ingênuo do lado direito ou pulmões esquerdos BALB/c virgens.
Não foram demonstradas diferenças nas fibras colágenas espessas. A análise de fibras finas de colágeno mostrou maior presença no modelo principal incompatível em comparação com o modelo menor incompatível, tecido pulmonar direito virgens ou pulmões esquerdos BALB/c virgens.
