Synthèse de la poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels pour Anisotropic Thermo-réactivité et organophile / Hydrophile Loading Capability

Résumé

We present a protocol to synthesize Janus microhydrogels composed entirely of the same base material, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), with a clearly compartmentalized structure base on the phase separation of a supersaturated NIPAAm monomer solution. The synthesized Janus microhydrogels show unique properties such as anisotropic thermo-responsiveness and organophilic/hydrophilic loading capability.

Résumé

Janus microparticles are compartmentalized particles with differing molecular structures and/or functionality on each of their two sides. Because of this unique property, Janus microparticles have been recognized as a new class of materials, thereby attracting a great deal of attention from various research fields. The versatility of these microparticles has been exemplified through their uses as building blocks for self-assembly, electrically responsive actuators, emulsifiers for painting and cosmetics, and carriers for drug delivery. This study introduces a detailed protocol that explicitly describes a synthetic method for designing novel Janus microhydrogels composed of a single base material, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm). Janus microdroplets are firstly generated via a hydrodynamic focusing microfluidic device (HFMD) based on the separation of a supersaturated aqueous NIPAAm monomer solution and subsequently polymerized through exposure to UV irradiation. The resulting Janus microhydrogels were found to be entirely composed of the same base material, featured an easily identifiable compartmentalized morphology, and exhibited anisotropic thermo-responsiveness and organophilic/hydrophilic loading capability. We believe that the proposed method introduces a novel hydrogel platform with the potential for advanced synthesis of multi-functional Janus microhydrogels.

Introduction

Hydrogels are a network of hydrophilic polymer chains.¹ An increasing amount of research in the field of hydrogels has promoted significant advances and revealed their similarity to biological tissues; the properties of hydrogels allow the uptake of large amounts of water while maintaining their structure. Environmentally responsive hydrogels have also been studied extensively because of their ability to swell or shrink reversibly in response to external stimuli.² Several triggers, including temperature,^3-5 pH,^6,7 light,^8,9 electric fields,^10,11 and specific molecules, such as glucose,^12,13 have been suggested to control the geometric shape of hydrogels. Among the many environmentally responsive hydrogels currently available, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), a well-known thermo-responsive hydrogel, exhibits volume shrinkage above a low critical solution temperature (LCST) of 32 °C.¹⁴ A recent study by Sasaki et al.¹⁵ reported the intriguing liquid-liquid phase separation of supersaturated NIPAAm, which is the monomer of PNIPAAm. According to this report, supersaturated NIPAAm was dissolved with a 10-fold molar excess of H₂O, and soon after, the solution separated into two liquid phases when allows to stand at a temperature above 25 °C; by contrast, dilute NIPAAm was dissolved homogeneously under the same conditions.

Microparticles made of environmentally responsive hydrogels are fascinating candidates for application in drug delivery,^16,17 catalysis,¹⁸ sensing,^19,20 and photonics.²¹ Traditional synthetic methods including emulsion polymerization, are used to produce hydrogel microparticles with polydispersity.^22,23 However, certain applications require microparticles with a narrow size distribution, for example, to stabilize the pharmacokinetics of drug delivery.²⁴ Irregularly shaped or polydisperse embolic microparticles aggregate proximally into clusters, leading to chronic inflammatory responses in embolic particles for cancer therapeutic treatment.^25,26

The microfluidic approach is at the forefront of research as a means of fabricating micro-sized particles with narrow size distributions and complex shapes.^27-31 The advantages of fabricating microparticles in the microfluidic device are predicated by the small characteristic length of the microfluidic device, which results in a low Reynolds number. In contrast to traditional bulk emulsification where drops are formed in parallel, microdroplets produced in microfluidic devices are generated in series and subsequently polymerized into microparticles upon exposure to UV irradiation. The fundamental principle of droplet formation using a microfluidic device is balance between the interfacial tension and the shear force of the sheath fluid acting on the core fluid.

Despite the obvious advantages of microfluidic fabrication of droplets/particles, Janus droplets/particles consisting of the same base material are rarely reported because the internal morphology of these droplets/particles is generally disturbed by the diffusion and perturbation of the core fluids. To circumvent this intrinsic limitation, two groups recently reported the preparation of the Janus microparticles by employing heat-induced phase separation of colloidal nanoparticles and UV-directed phase separation.^32,33

To this end, we report a microfluidic approach to synthesize Janus microhydrogels entirely composed of a single base material and obtain a product with clearly compartmentalized morphology. Our approach is based on the primary concept of liquid-liquid phase separation of supersaturated NIPAAm monomer. The resulting Janus microhydrogels were found to possess unique properties including anisotropic thermo-responsiveness and organophilic/hydrophilic loading capability.

Protocole

1. Fabrication d'un moule maître pour la focalisation hydrodynamique dispositif microfluidique (MMPB) par photolithographie

1. La conception d' un photomasque pour la MMPB (figure 1a) à l' aide de conception (CAO) assistée par ordinateur suivant le protocole du fabricant.
2. Rincer une plaquette 4 'de silicium avec de l'acétone, l'alcool isopropylique (IPA), et désionisée (DI) pour enlever la poussière organique et inorganique de la plaquette.
3. Nettoyer la plaquette de silicium avec plasma O ₂ à 100 W de puissance pendant 5 minutes pour augmenter la force de liaison entre la plaquette et SU-8.
4. Spin-couche 4 ml de la résine photosensible négative SU-8 2150, sur la tranche à 3000 tpm pendant 30 secondes pour obtenir une épaisseur de 150 um (b1 de la figure 1b).
5. Placez la tranche revêtue SU-8 sur une plaque chauffante pendant 5 min à 65 ° C, régler la température à 95 ° C, puis laisser la plaquette sur la plaque chauffante pendant 30 minutes pour cuisson douce.
6. Placer ledestiné photomasque au- dessus de la plaquette et exposer à une lumière UV (260 mJ cm - ^2, 26 s pour 10 mW cm ^-2) dans un dispositif d' alignement de masque (b2 sur la figure 1b).
7. Effectuer la cuisson de post-exposition sur une plaque chauffante (65 ° C pendant 5 min puis 95 ° C pendant 12 minutes).
8. Développer la plaquette par immersion dans un bain de révélateur SU-8 pendant 10 min, puis le transférer dans révélateur frais pendant 5 secondes pour obtenir une surface propre.
9. Rincer la plaquette pendant 20 secondes avec de l' eau déminéralisée et le sécher pendant 10 secondes avec du gaz _N2 (b3 sur la figure 1b). Utilisez la plaquette fabriquée comme un moule maître pour polydiméthylsiloxane (PDMS) coulée dans la section 2.

2. Fabrication de la MMPB par PDMS Castings

1. Utilisez la plaquette à motif obtenu dans la section 1 du moule maître pour PDMS coulée.
2. Mélanger le pré-polymère PDMS et d'un agent de durcissement de façon homogène dans un rapport pondéral de 10: 1; par exemple, en utilisant 1 g d'agent de durcissement pour 10 g de PDMS pré Polymer.
3. Verser le PDMS prépolymère dans le moule maître et dégazer pendant 1 heure dans une chambre à vide (b4 à la figure 1b).
4. Placer le moule maître avec le PDMS prépolymère dans un four à 65 ° C pendant 3 h.
5. Couper les PDMS durcis dans la taille d'une puce unique à l'aide d'un scalpel. Décollez délicatement la réplique PDMS durci du moule maître à la main.
6. Répétez les étapes 02.02 à 02.05 pour obtenir une réplique PDMS identique.
7. Poinçonner les trous d'entrée et de sortie dans l'une des répliques à l'aide d'un trou perforateur ayant un diamètre légèrement inférieur au diamètre extérieur du tube de raccordement.
8. Appliquer un traitement au plasma d'air à la zone de liaison de chaque réplique en utilisant un dispositif de traitement corona. ³⁴
   Attention: Utilisez le treater corona dans une zone avec une bonne ventilation pour éviter l' accumulation de l' ozone.
9. Déposer 5 pl de méthanol sur les zones de plasma traité par air. aligner Finement deux PDMS identiques répliques pour fabriquer la MMPB par manipu main lation, et vérifier l' alignement au moyen d' un microscope (b5 dans la figure 1b).
   Remarque: L'air du plasma traité répliques PDMS sont assez collante et difficile à manipuler. Ainsi, 5 ul de methanol est ajoutée à la surface traitée par plasma d'air pour fonctionner comme lubrifiant.
10. Placez la MMPB dans un four réglé à 65 ° C pendant la nuit pour renforcer le lien entre deux PDMS répliques (b6 à la figure 1b). Bond deux répliques identiques de PDMS pour augmenter la hauteur du microcanal de MMPB et évitent le colmatage des micro-gouttelettes dans le canal microfluidique au cours du fonctionnement.

Figure 1: Vue d' ensemble de la procédure MMPB de fabrication (a) Paramètres de conception du photomasque pour la MMPB.. (B) Illustration de la procédure de fabrication pour la MMPB.ftp_upload / 52813 / 52813fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Préparation de NIPAAm riche (N-riche), et NIPAAm pauvres (N-pauvres) Phases de séparation de phase de sursaturée NIPAAm

1. Dissoudre NIPAAm monomère dans de l'eau DI à un rapport p / p de 1: 1 en utilisant un mélangeur à vortex; Par exemple, on dissout 10 g de NIPAAm dans 10 ml d'eau déminéralisée (première image de la figure 2a).
   Remarque: Une fois que le monomère NIPAAm est complètement dissous à la température ambiante, la solution apparaît turbide (deuxième image de la figure 2a). Ce phénomène est le premier indice que la séparation de phase induite solubilité du monomère NIPAAm sursaturée a eu lieu avec succès.
2. Permettre à la solution de monomère au repos dans une position verticale à température ambiante pendant au moins 15 min. La phase supérieure est la phase N-riche, et la phase plus dense en bas est la N-pauvre phase (troisième image de la figure 2a). Les densités de thphases e N-riche et N-pauvres sont de 0,93 ± 0,01 et 0,99 ± 0,01 g cm ^-3, respectivement. ¹⁵
3. Lorsque l'interface séparant les deux phases devient clair, extraire soigneusement 2 ml de solution de monomère à partir des phases N-riches et N-pauvres sans perturber cette interface à l'aide d'une pipette.
4. Ajouter 4 mg de N, N '-methylenebisacrylamide (MBAAm) comme agent de réticulation et 4 mg de 4- (2-hydroxyéthoxy) phényl- (2-hydroxy-2-propyl) cétone comme photoinitiateur à l'extrait riche en N et N -poor solutions de monomères pour préparer les fluides noyau 1 et 2 pour la concentration en agent de réticulation faible (2 mg ml ^-1) échantillon (B1 et B2 sur la figure 2b).
5. Répétez l'étape précédente 3.3 et ajoutez 80 mg de MBAAm et 4 mg de 4- (2-hydroxyéthoxy) phényl- (2-hydroxy-2-propyl) cétone dans chacun des extraits solution de monomère N-riche et N-pauvres pour préparer les fluides de base 1 et 2 pour la haute concentration en agent de réticulation (40 mg ml ^-1) échantillon (B3 et B4 à la Figure 2b).
6. Dissoudre 10% en poids d'agent tensio - actif à l'huile dans une huile minérale pour préparer le fluide de gaine (b5 sur la figure 2b).

Figure 2:. Préparation du matériel pour Janus Microhydrogel Synthèse (a) Préparation de solutions de monomères N-riches et N-pauvres à travers la séparation de phase de sursaturée NIPAAm. (B) Les détails des matériaux et dispositif expérimental utilisé dans le protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Synthèse de Janus Microhydrogels Utilisation de la MMPB

1. Charge 2 ml de liquide de base 1 et 2 (b1, b2 b3 ou b4 in fi gure 2b) et le fluide de gaine (b5 sur la figure 2b) séparées en trois seringues de 3 ml.
2. Monter les seringues dans les pompes à seringue et connecter chaque seringue à l'entrée de fluide appropriée de la MMPB en utilisant un tube (Figure (b). Utiliser un tube pour connecter la sortie de fluide de la MMPB à un réservoir de collecte.
3. Définissez les pompes à seringue et laisser infuser des fluides de base 1 et 2 et fluide gaine à des taux de 2, 2, et 10 min pi ^-1 flux, respectivement.
4. (Facultatif) Régler le débit de fluides de base 1 et 2 écoulement pour ajuster les rapports de volumes relatifs de chaque côté de la Janus microgouttelettes.
5. Positionner la source de lumière UV perpendiculairement à environ 1 cm à partir du réservoir de collecte. Allumez la source de lumière UV et de suivre visuellement la production continue de microhydrogels Janus.
   Attention: L' utilisation UV de protection-lunettes lors de la surveillance de la production microhydrogel.
6. Ramassez les microhydrogels Janus fabriqués dans un tube conique et lavez-les à l'aide de l'IAP. Ensuite, centrifuger le tube conique (780 g pendant 5 min) pour régler lamicrohydrogels.
7. Répétez l'étape 4.6 plusieurs fois pour éliminer l'huile minérale entourant les microhydrogels Janus complètement.
8. Répétez l'étape 4.6, mais l'utilisation d'eau DI avec un tensioactif d'eau de 0,005% (v / v) à la place de l'IPA pour enlever l'IPA restes autour des microhydrogels Janus.
9. Rangez microhydrogels Janus complètement lavés dans un flacon de 10 ml contenant de l'eau DI.

5. Analyse de l'Anisotropic Thermo-réactivité de Janus Microhydrogels

1. Utiliser une pipette pour placer microhydrogels Janus synthétisées à partir de la section 4 dans une plaque de 24 puits. Laisser les microhydrogels se déposer pendant 15 secondes jusqu'à ce qu'une monocouche se forme à la surface du fond du puits.
2. Obtenir une image de la Janus microhydrogel à 24 ° C en utilisant un microscope optique en position verticale avec une lentille d'objectif 5X.
3. Fixer un module thermo-électrique sous la plaque de puits et à contrôler la tension de ce module pour augmenter la température de la solution contenant les micro Janushydrogels à 32 ° C.
4. Obtenir une image de la microhydrogel Janus à 32 ° C une fois de plus à l'aide d'un microscope optique verticale avec un objectif 5X.
5. Répétez les étapes 5,2-5,4 24 fois, en prenant soin de choisir un microhydrogel Janus différent pour l'analyse statistique.
6. A partir des 25 images de différents microhydrogels Janus à 24 et 32 ​​° C, mesurer le rayon des parties PN-riches et PN-pauvres des microhydrogels Janus en utilisant un logiciel d'analyse d'images selon les instructions du fabricant.

Résultats

La figure 3a présente un schéma du dispositif expérimental utilisé pour synthétiser microhydrogels Janus via le MMPB. Les phases riches en azote et la N-pauvres étaient précisément injectés dans la MMPB comme fluides de base 1 et 2, puis fusionnés et divisés en microgouttelettes Janus à l'orifice par le fluide d'enveloppement d'une huile minérale en raison de l'instabilité capillaire de Rayleigh. Par conséquent, microgouttelettes J...

Discussion

Deux matériaux de base non miscibles sont généralement utilisés pour synthétiser les microhydrogels Janus. Jusqu'à récemment, microhydrogels Janus composé de la même matière de base ont été rarement signalés et les microhydrogels rapportés Janus n'a pas eu une morphologie interne claire en raison de la perturbation causée par la miscibilité des matériaux constitutifs. ^{35, 36} Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour synthétiser microhydrogels Janus composées entièrement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafer	LG Siltron	4", Test grade	Wafer for master mold fabrication
Acetone	Samchun Pure Chemical	A0097	Cleaning silicon wafer
Isopropyl alcohol (IPA)	Daejung Chemicals & Metals	5035-4404	Cleaning silicon wafer
Water purification system	Merck Millipore	EMD Millipore RIOs Essential 5	Prepering  deionized water
O2 plasma machine	Femto Science	VITA-A	Cleaning silicon wafer
SU-8 2150 negative photoresist	MicroChem	Y111077 0500L1GL	Photoresist for master mold fabrication
Hot plate	Misung Scientific	HP330D, HP150D	Baking SU-8
SU-8 developer	Microchem	Y020100 4000L1PE	Developing SU-8
Mask aligner system for photolithograpy	Shinu Mst Co.	CA-6M	Photolithography
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	1064891	PDMS casting
Laboratory Corona Treater	Electro-technic Products Inc.	Model BD-20AC	PDMS air plasma treatment
N-isopropylacrylamide (NIPAAm)	Sigma-Aldrich	415324-50G	Monomer
N,N'-methylenebisacrylamide (MBAAm)	Sigma-Aldrich	146072-100G	Crosslinker of NIPAAm
4-(2-hydroxyethoxy)phenyl-(2-hydroxy-2-propyl)ketone, Irgacure 2959	BASF	55047962	Photoinitiator of NIPAAm
ABIL EM 90	Evonik Industries	201109	Sufactant for oil
Vortex mixer	Scientific Industries Inc.	Vortex-Genie 2	Mixing
Tygon tubing	Saint-Gobain	I.D. 1/32", O.D. 3/32", Wall 1/32"	Connecting tube between syringes and HFMD
UV light source	Hamamatsu	Spot light source LC8	Polymerization from NIPAAm to PNIPAAm
Syringes, NORM-JECT (3ml)	Henke-Sass Wolf GmbH	22767	Loading of materials
Syringe pump	KD Scientific	KDS model 200	Perfusion of materials
Tegitol Type NP-10	Sigma-Aldrich	NP10-500ML	Surfactant for water
Oil red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dye for N-rich phase
Oil Blue N	Sigma-Aldrich	391557-5G	Dye for N-rich phase
Yellow food dye	Edentown F&B	NA	Dye for N-poor phase
Green food dye	Edentown F&B	NA	Dye for N-poor phase
Power supply	Agilent	E3649A	Power soruce for thermoelectric moduel
Thermoelectric module	Peltier	FALC1-12710T125	Temparature control
Centrifuge machine	Labogene	1248R	Settling down microhydrogels
24-well plate	SPL Life Sciences	32024	Reservoir for observation
Optical microscope	Nikon	ECLIPSE 80i	Optical observation
Image analysis software	IMT i-Solution Inc.	iSolutions DT	Measurement of radius