Production à l’échelle sans cellules et ajout d’adjuvant à une protéine recombinante de la membrane externe majeure de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de kits commerciaux d’expression protéique acellulaire pour produire des protéines membranaires supportées dans des nanodisques qui peuvent être utilisées comme antigènes dans les vaccins sous-unitaires.

Résumé

Les vaccins sous-unitaires offrent des avantages par rapport aux vaccins inactivés ou atténués plus traditionnels dérivés de cellules entières en termes d’innocuité, de stabilité et de fabrication standard. Pour obtenir un vaccin sous-unitaire à base de protéines efficace, l’antigène protéique doit souvent adopter une conformation de type natif. Ceci est particulièrement important pour les antigènes pathogènes de surface qui sont des protéines liées à la membrane. Des méthodes acellulaires ont été utilisées avec succès pour produire des protéines membranaires fonctionnelles correctement repliées grâce à la co-traduction de particules de nanolipoprotéines (PNL), communément appelées nanodisques.

Cette stratégie peut être utilisée pour produire des vaccins sous-unitaires constitués de protéines membranaires dans un environnement lié aux lipides. Cependant, la production de protéines acellulaires est souvent limitée à petite échelle (<1 mL). La quantité de protéines produites en petites séries est généralement suffisante pour les études biochimiques et biophysiques. Cependant, le processus sans cellules doit être mis à l’échelle, optimisé et soigneusement testé pour obtenir suffisamment de protéines pour les études vaccinales sur des modèles animaux. D’autres processus impliqués dans la production de vaccins, tels que la purification, l’ajout d’adjuvants et la lyophilisation, doivent être optimisés en parallèle. Cet article rend compte de l’élaboration d’un protocole à grande échelle pour exprimer, purifier et formuler un vaccin sous-unitaire protéique lié à la membrane.

Les réactions acellulaires à grande échelle nécessitent une optimisation des concentrations et des rapports plasmidiques lors de l’utilisation de vecteurs d’expression plasmidique multiples, de la sélection des lipides et de l’ajout d’adjuvants pour la production à haut niveau de particules de nanolipoprotéines formulées. La méthode est démontrée ici avec l’expression d’une protéine de membrane externe majeure (MOMP) chlamydiale mais peut être largement appliquée à d’autres antigènes de protéines membranaires. L’efficacité des antigènes peut être évaluée in vivo au moyen d’études d’immunisation pour mesurer la production d’anticorps, comme démontré ici.

Introduction

Les lysats procaryotes ou eucaryotes pour l’expression cellulaire de protéines sont facilement disponibles en tant que produits commerciaux pour synthétiser des protéines d’intérêt (pour une revue complète, voir ¹). Ces systèmes d’expression sont disponibles à différentes échelles et utilisent des lysats de divers organismes, y compris E. coli, les plants de tabac et les cultures de mammifères. Les lysats acellulaires offrent de multiples avantages par rapport aux approches traditionnelles de production de protéines recombinantes, notamment la facilité d’utilisation et la production robuste et rapide de protéines. Bien que ces approches soient principalement utilisées pour produire des protéines solubles, ce groupe a mis au point une approche pour leur utilisation pour exprimer les protéines membranaires.

Cette nouvelle approche apporte des modifications mineures aux systèmes d’expression acellulaires existants en incluant de l’ADN codant pour deux produits protéiques pour l’expression, une apolipoprotéine et la protéine membranaire d’intérêt. L’apolipoprotéine exprimée (dérivés de l’ApoA1 ou de l’ApoE4) interagit avec les lipides ajoutés au lysat acellulaire pour assembler spontanément (~20 nm) les PNL. Lorsqu’ils sont co-traduits avec une protéine membranaire d’intérêt, la protéine NLP et la protéine membranaire forment un complexe de nanoparticules solubles dans lequel la protéine membranaire est intégrée dans la bicouche lipidique NLP. Ainsi, la protéine membranaire est plus accessible pour les applications en aval, car elle est contenue dans des particules solubles et discrètes. Cette approche peut produire des complexes protéiques oligomères fonctionnels dans la bicouche² NLP et peut produire le composant antigénique d’un vaccin sous-unitaire, qui est ensuite mélangé avec des adjuvants lipophiles pour former un vaccin à nanoparticules comportant un antigène colocalisé et un adjuvant adapté à l’évaluation in vivo .

Cette méthode actuelle est modifiée à partir d’un protocole³ précédemment publié. Les modifications clés sont axées sur la mise à l’échelle de la réaction acellulaire et la purification ultérieure du complexe protéique-NLP. Une autre modification comprend l’ajout d’un polymère amphiphile connu sous le nom de télodendrimère, qui est d’abord mélangé avec les lipides avant d’être ajouté à la réaction acellulaire. La co-traduction des plasmides en présence du télodendrimère et des lipides produit un NLP télodendrimère (tNLP). L’ajout du télodendrimère permet également de moduler la taille et la monodispersité des nanoparticules de tNLP^{résultantes 4}. Ce protocole est spécifiquement optimisé pour les études vaccinales à grande échelle afin de produire une protéine d’antigène sous-unitaire liée à la membrane, chlamydia MOMP ^5,6. La méthode produit un MOMP recombinant associé à la TNLP pour former un complexe MOMP-tNLP hautement soluble qui conserve l’oligomérisation de MUT. Une production typique de 3 ml à l’échelle donne >1,5 mg de MOMP purifié. Le MOMP-tNLP produit sans cellules se prête à une addition rapide d’adjuvant pour les tests d’immunogénicité in vivo.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées à l’Université de Californie à Irvine, dans des installations assurées par le Service de santé publique (PHS), conformément aux directives établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.

1. Préparation de la verrerie

REMARQUE : Tous les matériaux utilisés dans la production de formulations de qualité vaccinale pour les animaux sont exempts d’endotoxines.

1. Pour détruire les endotoxines contaminantes, faites cuire de la verrerie nettoyée qui retiendra les tampons dans une étuve à 180 °C pendant 4 h.

2. Préparation du tampon

1. Préparer 250 mL des tampons de purification par affinité Ni énumérés dans le tableau 1. Conservez-les à 4 °C jusqu’à 6 mois.

3. Préparation de la réaction

1. Peser 20 mg de 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL sans endotoxines. Dissoudre dans 1 mL d’eau exempte d’endotoxines, sonder au moins quatre fois à 6 A pendant 1 min, avec 1 minute de pause entre les deux, jusqu’à ce qu’il soit clair. Retirer tout métal contaminant de la sonde par centrifugation à 13 000 × g pendant 2 min à 22 °C, puis transférer le lipide solubilisé dans un nouveau tube exempt d’endotoxines de 1,5 mL.
2. Peser 1 mg de télodendrimère PEG5k-CA8 dans un tube sans endotoxines de 1,5 mL. Dissoudre dans de l’eau exempte d’endotoxines jusqu’à une concentration de 20 mg/mL. Vortex jusqu’à dissolution complète et diluer à 2 mg/mL.
3. Dans un nouveau tube exempt d’endotoxines, combiner 210 μL de solution DMPC à 20 mg/mL avec 210 μL de solution de télodendrimère à 2 mg/mL.

4. Production sans cellules de MOMP-tNLP pour les formulations de vaccins sous-unitaires

1. Préparer des MOMP-tNLP en utilisant des méthodes sans cellules modifiées à partir d’un protocole précédemment publié⁵.
   1. Deux heures avant de mettre en place la réaction acellulaire, ouvrez le kit d’expression procaryote des protéines acellulaires et décongelez l’un des tampons de reconstitution. Une fois décongelé, ajoutez un comprimé de cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA et laissez-le se dissoudre complètement.
2. Suivez ce protocole à l’aide d’un kit conçu pour exécuter des réactions de 5 x 1 mL.
   REMARQUE : Une production de mise à l’échelle typique est de 3 x 1 mL.
   1. Pour chaque réaction de 1 mL, ajouter 525 μL de tampon de reconstitution dans le flacon de lysat d’E. coli et rouler doucement pour dissoudre. Ajouter 250 μL de tampon de reconstitution dans le flacon contenant des additifs réactionnels (p. ex. ATP, GTP) et rouler doucement pour dissoudre.
   2. Ajouter 8,1 mL de tampon de reconstitution dans le flacon d’alimentation réactionnelle, reboucher avec un bouchon en caoutchouc (prendre soin de ne pas toucher l’intérieur du bouchon en caoutchouc) et inverser/rouler doucement pour dissoudre.
   3. Ajouter 3 ml de tampon de reconstitution dans le flacon de mélange d’acides aminés, reboucher avec un bouchon en caoutchouc et inverser/rouler doucement pour dissoudre.
      REMARQUE: Veillez à ne pas toucher l’intérieur du bouchon en caoutchouc car cela pourrait entraîner une contamination.
   4. Ajouter 1,8 mL de tampon de reconstitution dans le flacon de méthionine, rouler doucement pour dissoudre, puis conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
3. Préparer la solution réactionnelle.
   1. Dans le flacon de lysat d’E. coli , ajouter 225 μL de mélange réactionnel reconstitué, 270 μL de mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 30 μL de méthionine reconstituée. De plus, ajoutez 400 μL du mélange DMPC/télodendrimère, 15 μg de plasmide MOMP et 0,6 μg de plasmide Δ49ApoA1. Rouler/agiter doucement pour mélanger.
      REMARQUE: Assurez-vous que les deux plasmides sont construits à partir du même squelette plasmidique. Ne pas vortex.
   2. Prélever 20 μL de la solution totale et la mettre de côté dans un tube de 1,5 mL pour la réaction de contrôle exprimant la GFP (voir ci-dessous).
4. Préparer la solution alimentaire. Dans le flacon de mélange d’aliments, ajouter 2,65 mL de mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 300 μL de méthionine reconstituée. Rouler/agiter doucement pour dissoudre.
   REMARQUE : À ce stade, le tampon de reconstitution inutilisé et la méthionine peuvent être retournés au congélateur pour entreposage.
5. Transférer 1 mL de la solution réactionnelle dans la chambre de réaction interne fournie dans la trousse de réaction sans cellule et sceller une fois remplie. Transférer 10 mL de la solution d’alimentation dans la chambre extérieure de la cuve de réaction et du joint.
   REMARQUE: Ne remplissez pas trop les chambres! La présence de bulles d’air au sommet de la chambre de réaction interne et de la chambre d’alimentation interne affectera négativement la réaction. Toute solution réactionnelle restante peut être placée dans un tube de 1,5 mL et laissée mélanger le long du récipient principal.
6. Ajouter 0,5 μL du plasmide témoin GFP (0,5 mg/mL) au mélange réactionnel de 20 μL précédemment aliquote.
   REMARQUE: De nombreux kits sont fournis avec un plasmide de contrôle à des fins de contrôle de la qualité. La plupart des plasmides exprimant la GFP avec un promoteur T7 et un site de liaison au ribosome E. coli (RBS) peuvent également être utilisés comme plasmide témoin.
7. Placer la réaction dans un agitateur à 300 tr/min, 30 °C pendant 18 h maximum. Pour vérifier que la réaction a réussi, utilisez une source de lumière UV pour vérifier la fluorescence due à la synthèse de la GFP de contrôle (Figure 1A) après aussi peu que 15 minutes d’incubation.
   REMARQUE: Ces conditions, en particulier la température, peuvent devoir être optimisées pour l’expression d’autres protéines membranaires.

5. Purification MOMP-tNLP

1. Utiliser la chromatographie d’affinité au nickel immobilisée pour purifier le complexe de nanoparticules MOMP-tNLP du mélange réactionnel acellulaire en utilisant le His-tag sur la protéine Δ49ApoA1.
   1. Transférer 1 mL d’une suspension à 50 % de résine de purification His-Tag dans une colonne de chromatographie jetable de 10 mL et l’équilibrer avec 3 mL de tampon de liaison.
   2. Laissez le tampon s’égoutter, bouchez la sortie et ajoutez 250 μL de tampon de liaison à la résine.
   3. Avant d’ajouter la réaction acellulaire à la colonne, économisez 20 μL pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE. Mélanger la réaction acellulaire avec la résine équilibrée et l’incuber sur une bascule de laboratoire à 4 °C pendant 1 h.
2. Décapsulez la colonne, lavez le bouchon avec 500 μL de tampon de liaison supplémentaire et ajoutez ce liquide au reste de la colonne.
3. Recueillir le flux liquide de la colonne pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE.
4. Laver la colonne avec 1 mL de tampon de lavage contenant 20 mM d’imidazole six fois et recueillir les fractions. Veillez à ne pas laisser la résine sécher entre les lavages. Au deuxième lavage, agiter vigoureusement la résine en la pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 mL.
5. Éluer les MOMP-tNLP dans six fractions de 300 μL du tampon Elution 1 (contenant 250 mM d’imidazole), suivi d’une élution finale avec 300 μL de tampon Elution 2 (contenant 500 mM d’imidazole). Lors de la deuxième élution, agiter vigoureusement la résine en la pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 mL.

6. Analyse par SDS-PAGE

NOTE: Toutes les fractions d’élution doivent être analysées par SDS-PAGE pour dépister la quantité et la pureté de la protéine d’intérêt.

1. Charge de 1 μL chacun du lysat total et de l’écoulement, puis de 5 μL pour tous les lavages et fractions d’élution recueillis.
   1. Mélanger les aliquotes du MOMP–tNLP élué, des lavages, de l’écoulement continu et du lysat total avec 4x tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE. Mélanger et dénaturer thermiquement les échantillons avec un agent réducteur d’échantillon 10x, sauf indication contraire.
   2. Analyser les fractions par électrophorèse sur gel en utilisant des gels Bis-Tris SDS-PAGE de 1,0 mm, 4 à 12 %, avec 1x tampon MES-SDS, ainsi qu’un étalon de poids moléculaire approprié. Faites couler les gels pendant 35 min à 200 V.
2. Colorer les gels selon les instructions du fabricant.
   1. Retirez le gel de la cassette et placez-le dans 60 ml de coloration de gel. Cuire le gel au micro-ondes dans la tache de gel pendant 30 s et bercer doucement le récipient pendant 30 s pour répartir la chaleur uniformément. Micro-ondes le gel dans la tache à 80–85 °C pendant encore 30 s et placer le gel sur un agitateur orbital pour basculer pendant 5 min.
   2. Micro-ondes le gel une troisième fois pendant 30 s, puis revenir à l’agitateur orbital pour basculer pendant encore 23 minutes.
   3. Transférer le gel dans un récipient propre et laver dans 100 mL de solution de lavage (10 % de méthanol, 7 % d’acide acétique) pendant 30 min.
      REMARQUE: Il s’agit d’une étape critique car il est essentiel d’éviter de chauffer la solution de lavage. Ne pas le faire peut entraîner des taches d’arrière-plan et des irrégularités dans l’image finale du gel.
   4. Après le lavage, rincer le gel à l’eau ultrapure deux fois pendant 5 minutes chacun.
   5. Imagez les gels à l’aide d’un imageur de gel à 600 nm (Figure 2). Utilisez SDS-PAGE pour quantifier la quantité de protéines individuelles dans la solution de nanoparticules s’il existe une norme protéique à des fins de comparaison.
      NOTA: Dans cet exemple, les dilutions en série de MOMP exprimés par recombinaison sont résolues par SDS-PAGE et les densités des bandes sont quantifiées à l’aide du logiciel de l’instrument.
   6. Générez une courbe standard en utilisant les densités des bandes MOMP. Résolvez les échantillons MOMP-tNLP sur le même gel SDS-PAGE et calculez la composante MOMP des particules à l’aide de la courbe standard MOMP (Figure 3).

7. Western et dot blots et stockage

1. Pour le transfert Western, résoudre les échantillons par SDS-PAGE et transférer les gels à l’aide d’un système commercial de transfert à sec avec des réglages standard selon le protocole du fabricant.
   1. Retirer les blots de la pile une fois le transfert terminé et incuber chaque transfert pendant une nuit à 4 °C dans un tampon de blocage approprié contenant 0,2% de Tween 20 et 0,5 mg / mL MAb40 ou 0,2 mg / mL d’anticorps anti-His-His dirigé contre le His-tag de la protéine Δ49ApoA1.
      REMARQUE : Les dilutions d’anticorps utilisées pour le buvard sont de 1:1 000 pour MAb40 et de 1:500–1 000 pour les anticorps MAbHIS.
   2. Laver chaque tache 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Incuber les transferts pendant 1 h dans un tampon de blocage contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (p. ex. IRDye) à une dilution de 1:10 000.
   4. Relaver les taches 3 fois pendant 5 min avec PBS-T. Utilisez un imageur à fluorescence pour imager les taches après le lavage final.
2. Pour les taches de points, transférer 3 μg de MOMP-tNLP purifié et tNLP vide à l’aide d’un appareil de transfert de points. Bloquer et développer les transferts en utilisant les mêmes méthodes décrites ci-dessus pour le transfert Western.

8. Évaluation des endotoxines

1. Quantifier les niveaux d’endotoxines à l’aide d’un système de test d’endotoxines basé sur le test Limulus Amebocyte Lysat (LAL). Préparer un tampon d’échantillon 25 mM Tris 25 mM, pH 7,4, sans endotoxines en utilisant une solution de chlorhydrate de Tris 1 M et de l’eau exempte d’endotoxines.
   NOTA : En règle générale, les échantillons doivent être dilués à l’aide de ce tampon d’échantillonnage, et les dilutions ajustées pour trouver la plage appropriée pour les échantillons individuels. Ici, les échantillons MOMP-tNLP sont dilués 500 fois dans un tampon d’échantillon et 25 μL sont chargés dans chaque puits d’une cartouche de dispositif avec une sensibilité de 0,05 EU/mL. Les niveaux d’endotoxines de MOMP-tNLP et de tNLP vide utilisés dans les études sur la souris décrites ci-dessous se situent entre 0,4 et 12 protéines EU/μg selon l’échantillon.

9. Lyophilisation

1. Lyophiliser et stocker les nanoparticules MOMP-tNLP pour une utilisation à long terme (jusqu’à des années) à -20 °C. Pour préparer les suspensions tNLP et MOMP-tNLP pour la lyophilisation, ajoutez du tréhalose comme protecteur pendant le processus de congélation et de lyophilisation.
   NOTE: Ce processus a été largement validé pour une variété de formulations tNLP ^7,8.
2. Diviser le volume actuel de la solution MOMP-tNLP par 9 pour obtenir le volume de tréhalose 1 M dans de l’eau désionisée stérile, exempte d’endotoxines, nécessaire pour atteindre une concentration finale de 0,1 M de tréhalose. Prenez note du volume final et aliquote dans des tubes en polypropylène de 15 mL ou 50 mL sans endotoxines, selon vos besoins.
3. Congeler la solution mélangée sur de la glace sèche et la lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’un lyophilisateur. Conservez les formulations séchées à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires.
4. Reconstituer les TNLP lyophilisées à l’aide d’eau exempte d’endotoxines. Rouler doucement jusqu’à ce que le gâteau lyophilisé soit complètement dissous et réhydraté. Pour éliminer le tréhalose, dialyser la solution contre le PBS à l’aide d’une membrane de dialyse de coupure de 3,5 kDa.

10. Ajout d’adjuvant

REMARQUE : Ces formulations vaccinales sous-unitaires à base de NLP et d’autres similaires peuvent facilement incorporer des adjuvants lipophiles tels que le CpG-ODN1826 et le FSL-1. Le CpG-ODN1826 est un oligonucléotide CpG de classe B modifié (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') avec un squelette phosphorothioate complet présentant un groupement 5' cholestérol (5'-chol-C6). La conjugaison de CpG-ODN1826 aux tNLP est médiée par les interactions hydrophobes entre la fraction cholestérol et la bicouche phospholipide de la TNP et a été démontrée et bien caractérisée, comme indiqué précédemment ^9,10.

1. Avant l’incorporation dans ces formulations, purifier le CpG modifié par chromatographie en phase inverse pour éliminer l’endotoxine contaminante ainsi que toutes les molécules de CpG non modifiées.
   1. Dès réception du fournisseur, réhydrater le matériau CpG lyophilisé dans de l’eau exempte d’endotoxines et le purifier sur une colonne PCLHP C4 RP préparative à l’aide d’un gradient de séparation constitué de 10 mM d’acétate de triéthylammonium (TEAA) (phase mobile A) et d’acétonitrile (phase mobile B).
      REMARQUE : Des détails supplémentaires sont disponibles dans le tableau 2.
   2. Pool et lyophiliser les fractions contenant du CpG modifié par le cholestérol. Pour assurer l’élimination complète du TEAA résiduel, reconstituer le CpG avec 15 mL d’eau exempte d’endotoxines et le relyophiliser trois fois.
   3. Après la lyophilisation finale, reconstituer le CpG dans de l’eau exempte d’endotoxines (concentration finale de CpG de >20 mg/mL), aliquote, et le conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Pour ajouter aux formulations, diluer le CpG à une concentration de 1 à 2,5 mg / mL.
      REMARQUE : Le FSL-1 est offert sous forme de poudre lyophilisée de qualité vaccinale. Celle-ci est reconstituée à l’aide d’eau stérile et exempte d’endotoxines à une concentration de 1 mg/mL. Le vaccin est administré par voie intramusculaire (i.m.), chaque dose contenant 10 μg de MOMP dans un volume total de 50 μL.
2. Pour obtenir la dose de formulation souhaitée, dialyser les nanoparticules dans du PBS et les concentrer à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide avant l’ajout d’adjuvant. Prenez soin lorsque vous faites cela d’éviter un séchage complet de l’échantillon - vérifiez le volume de l’échantillon toutes les 20 à 30 minutes pendant la centrifugation.
3. Ajouter l’adjuvant dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité. Pour évaluer la réussite de l’incorporation, analyser les formulations finales et leurs composants par chromatographie analytique taille-exclusion (SEC).
   NOTA : Pour ces préparations, une colonne SEC a été utilisée dans le tampon PBS (débit de 0,5 mL/m) et l’élution a été détectée à l’aide d’un détecteur à matrice de diodes UV-vis. L’incorporation a été évaluée en comparant l’absorption des particules adjuvantées à celle des particules sans adjuvant à 214 et 280 nm.
4. Conservez le MOMP-tNLP avec adjuvant et videz la TNLP à 4 °C avant l’utilisation de l’animal pendant une période allant jusqu’à 14 jours. Pour évaluer pleinement la stabilité d’une nouvelle formulation de TNLP, analyser périodiquement les tNLP stockés par SEC.
   REMARQUE: La stabilité varie d’une formulation à l’autre.

11. Analyses sériques

1. Obtenir des souris femelles âgées de 3 semaines (BALB/c, n = 6).
2. Vacciner les souris par voie intramusculaire (i.m.) dans chaque membre postérieur avec 10 μg de MOMP sous forme d’adjuvant MOMP-tNLP avec 5 μg de CpG et 1 μg de FSL-1 (volume total par injection = 50 mL).
3. Après la vaccination, observez les souris jusqu’à ce qu’elles soient capables de maintenir une position couchée sternale.
4. Quatre semaines après la vaccination initiale (prime), vacciner les animaux une deuxième fois (boost) avec 10 μg de MOMP sous forme d’adjuvant MOMP-tNLP avec 5 μg de CpG et 1 μg de FSL-1 (volume total par injection = 50 mL).
5. Le jour 56 après la vaccination initiale, prélever du sang pour évaluer les titres d’anticorps. Commencez par anesthésier les souris en injectant par injection une solution de xylazine (0,3 mg/20 g de poids corporel) et de kétamine (3,0 mg/20 g de poids corporel). Pincez les pattes avant et postérieures pour vous assurer qu’il n’y a pas de secousses. Appliquez de la vaseline autour des yeux pour prévenir la sécheresse oculaire pendant l’anesthésie.
6. À l’aide d’un tube capillaire micro-hématocrite, percer le plexus rétro-orbitaire. Prélever 100 mL de sang dans un tube à microcentrifugeuse.
7. Après la collecte de sang, observez les souris jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie et puissent maintenir une position couchée sternale.
8. Laissez le sang coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, puis tournez vers le bas à 2 000 × g pendant 10 minutes. Prélever le sérum et le congeler à -80 °C.
9. À ce moment-là, défiez les animaux avec Chlamydia muridarum ou euthanasiez-les. Euthanasier les souris en injectant d’abord par injection intraveineuse une solution de xylazine (0,3 mg/20 g de poids corporel) et de kétamine (3,0 mg/20 g de poids corporel) suivie d’une luxation cervicale.
10. Testez les anticorps sériques spécifiques de MOMP en utilisant les techniques de transfert Western décrites ci-dessus. Mélangez les sérums de souris de toutes les souris immunisées et utilisez le sérum combiné à la place d’un anticorps primaire à une dilution de 1:5 000.

Résultats

Le profil SDS-PAGE de la purification par affinité Ni de MOMP-tNLP à partir d’une réaction sans cellules de 1 mL est illustré à la figure 1B. La réaction a entraîné des niveaux élevés d’expression pour le MOMP et la protéine Δ49ApoA1. Des résultats antérieurs ont montré que l’expression acellulaire de Δ49ApoA1 en présence de DMPC et de télodendrimère entraînait la formation de particules de nanolipoprotéines de télodendrimères (tNLP)⁴. La co-élution de MOMP avec Δ49ApoA1 a indiqué que MOMP est associé aux TNLP, car le His-tag n’est présent que sur l’échafaudage tNLP Δ49ApoA1 et non sur MOMP. MOMP est une protéine hautement insoluble qui ne peut être éluée que par complexation avec des tNLP, dont il a été démontré qu’elle facilite la solubilisation des protéines membranaires.

Les fractions d’élution contenant des MOMP-tNLP ont été regroupées et la concentration totale de protéines a été déterminée à l’aide d’un dispositif de quantification basé sur la fluorescence, ou d’un dispositif qui mesure la concentration par absorbance à 280 nm, en suivant les instructions du fabricant pour la quantification des protéines. Pour permettre un dosage précis du vaccin MOMP, il est également important de déterminer la concentration de MOMP dans les complexes purifiés. Nous avons développé une méthode pour quantifier le MOMP basée sur la densitométrie sur gel (Figure 2) dans laquelle un MOMP recombinant purifié avec une concentration connue a été utilisé comme norme. En établissant la courbe standard et en la comparant à l’échantillon MOMP-tNLP, la concentration de MOMP peut être quantifiée avec précision. La détermination de la concentration de MOMP dans l’échantillon purifié a permis d’estimer le rendement du MOMP dans les réactions acellulaires à différentes échelles, ce qui est important pour la planification de la configuration de la réaction appropriée aux études en aval (tableau 3).

MOMP doit former des oligomères pour provoquer une réponse immunitaire robuste¹¹. Pour tester l’état oligomérique de MOMP, MOMP-tNLP a été analysé en présence et en absence de chaleur et de l’agent réducteur dithiothréitol (DTT, 50 mM, Figure 3A). Des oligomères d’ordre supérieur de MOMP ont été identifiés par SDS-PAGE lorsque les échantillons n’ont pas été traités par chaleur et DTT. En comparaison, les échantillons traités à la chaleur en présence de TNT présentaient principalement deux bandes distinctes sur le gel, correspondant au MOMP et au Δ49ApoA1 (environ 40 kDa et 22 kDa, respectivement). Ces résultats ressemblent beaucoup au modèle de bandes de gel attribué à la formation d’oligomères de MOMP, ce qui est essentiel à son efficacité.

Une analyse par transfert Western ultérieure utilisant MAb40, un anticorps dirigé contre l’épitope linéaire sur le domaine variable de la protéine MOMP, a montré un schéma de bandes similaire, confirmant la formation d’oligomères par la protéine MOMP dans son état non dénaturé (Figure 3B). Un facteur important ayant un impact sur la formation d’oligomères MOMP est le rapport entre le plasmide MOMP et le plasmide Δ49ApoA1 lors de la configuration de la réaction acellulaire. Le tableau 4 énumère le rapport des plasmides et le taux d’insertion de MOMP dans les TNLP. Des études antérieures ont indiqué que le MOMP chlamydia et d’autres protéines de la membrane externe peuvent exister principalement sous forme de trimères¹². Pour maximiser la formation de trimères dans la réaction acellulaire, il est souhaitable d’avoir un taux d’insertion proche de trois protéines MOMP par NLP, ce qui correspond à un rapport plasmidique ~25:1 MOMP-to-Δ49ApoA1.

Un test par transfert de points a été utilisé comme méthode plus rationalisée pour détecter la présence de MOMP et de tNLP. L’anticorps MAb40 a été utilisé pour détecter le MOMP total. L’anticorps MAbHIS ciblant le marqueur His sur l’échafaudage Δ49ApoA1 de la TNLP a été utilisé pour évaluer la présence de tNLP. La co-signalisation des anticorps MAb40 et MAbHIS a indiqué la formation de MOMP-tNLP. La réaction de contrôle a produit une PNLT vide, qui n’a montré qu’un signal positif de MAbHIS (Figure 3C). Pour tester l’immunogénicité des MOMP-tNLP produites dans la réaction acellulaire, nous avons adjuvanté MOMP-tNLP avec CpG + FSL-1 et injecté par voie intramusculaire (i.m.) à des souris dans un régime prime-boost comme décrit ci-dessus. Des sérums ont été prélevés sur les souris immunisées, et les anticorps IgG spécifiques du MOMP ont été mesurés à l’aide d’un test Western blot (Figure 4). Les sérums de souris injectées avec adjuvanté MOMP-tNLP ont montré une forte liaison MOMP, indiquant que MOMP-tNLP pourrait provoquer une réponse immunitaire in vivo.

Figure 1 : Expression et purification de MOMP-tNLP. (A) Image de tubes contenant de petites aliquotes d’une réaction acellulaire qui a exprimé avec succès des contrôles GFP éclairant sous source de lumière UV (à droite) par rapport à des lysats sans plasmide GFP (à gauche). (B) Le gel de protéines coloré avec SYPRO Ruby après SDS-PAGE montre le profil de purification de MOMP-tNLP. MOMP migre à 40 kDa et le 49ApoA1 migre à 22 kDa. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; GFP = plasmide fluorescent vert codant pour les protéines; MW = marqueur de poids moléculaire; T = lysat total acellulaire; FT = accréditive; R1-R3 = aliquotes de réaction acellulaire; W1, W6 = Lavages 1 et 6; E1-E7 = Élutions 1 à 7; Δ49ApoA1 = Dérivé ApoA1 de souris marqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification de MOMP dans des échantillons MOMP-tNLP. (A) Gel SDS-PAGE coloré avec SYPRO Ruby pour la quantification de MOMP. Le MOMP recombinant avec concentration connue a été chargé sur le gel pour obtenir la courbe standard. Chaque voie contenait 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg et 4,0 μg de MOMP. Les échantillons MOMP-tNLP quantifiés ont été chargés sur le même gel. (B) La courbe étalon de concentration MOMP a été générée par densitométrie. Une équation reliant la densité de bande normalisée et la quantité de MOMP a été établie. L’équation a été utilisée pour calculer la teneur en MOMP dans les échantillons inconnus. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : La MOMP-tNLP produite sans cellules permet à MOMP de former des structures d’ordre supérieur. (A) Gel SDS-PAGE de MOMP-tNLP avec et sans traitement thermique et agent réducteur DTT, coloré au rubis SYPRO. Avec la chaleur et la TNT, MOMP est principalement apparu comme une bande monomère à ~40 kDa, car la chaleur et l’agent réducteur ont brisé la majorité de la structure MOMP d’ordre supérieur. En l’absence de chaleur et de TNT, les bandes d’ordre supérieur étaient présentes, indiquant une conformation d’oligomères MOMP. (B) Western blot de MOMP-tNLP et MOMP seul, non traité et traité à la chaleur et au DTT. Après transfert, la membrane a été sondée avec MAb40 (dilution 1:1 000). Un motif de bandes similaire au gel coloré SYPRO Ruby a été observé, confirmant que les bandes de poids moléculaire plus élevées étaient bien des oligomères MOMP. (C) Transfert de points d’échantillons MOMP-tNLP et tNLP vides (en double) sondés avec MAb40 et MAbHIS. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium polyacrylamide; DTT = dithiothreitol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : La MOMP-tNLP produite sans cellules est hautement immunogène. Le sérum de souris immunisées a montré un fort signal d’IgG anti-MOMP. L’adjuvant MOMP-tNLP avec CpG + FSL-1 a été utilisé pour immuniser les souris. Les sérums de six souris immunisées ont été collectés, regroupés et utilisés pour sonder MOMP-tNLP. Le sérum a pu se lier au MOMP lors d’un test Western blot et a montré un fort signal IgG (à gauche). Le transfert Western utilisant MAb40 comme anticorps primaire (à droite) a montré des bandes similaires, indiquant que le sérum contenait des IgG spécifiques de MOMP. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; CpG = adjuvant CpG modifié par le cholestérol; FSL-1 = adjuvant lipophile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de la mémoire tampon	NaH2PO4	NaCl	Imidazole	pH
Tampon de liaison	50 mM	300 mM	10 mM	8.0
Tampon de lavage	50 mM	300 mM	20 mM	8.0
Tampon d’élution 1	50 mM	300 mM	250 mM	8.0
Tampon d’élution 2	50 mM	300 mM	500 mM	8.0

Tableau 1 : Liste des tampons nécessaires à la purification par affinité du nickel, détaillant les concentrations de chaque composant et le pH.

Duree	50 min
Débit	6,0 mL/min
Type de dégradé	Binaire
Tampon A	10 mM TEAA en H20
Tampon B	MeCN
Pente	% Tampon B
0 min	25%
30 min	60%
30,5 min	100%
40 min	100%
40,5 min	25%
50 min	25%

Tableau 2 : Conditions pour la purification par CLHP en phase inversée de CpG modifié par le cholestérol. Abréviations : TEAA = acétate de triéthylammonium; MeCN = acétonitrile.

Lysat sans cellules (mL)	Lipide DMPC (mg)	Télodendrimère (mg)	MOMP plasmide (μg)	Rendement MOMP purifié (mg)
1	4	0.4	15	0.5
2	8	0.8	30	1.1
3	12	1.2	45	1.6
5	20	2	75	2.7

Tableau 3 : La quantité de lipides, de télodendrimères et de plasmides utilisés pour des réactions acellulaires à différentes échelles et les rendements correspondants. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine.

Ratios d’entrée plasmidique, MOMP : Δ49ApoA1		1:1	5:1	10:1	25:1	50:1	100:1
Rapports de la quantité de protéines produites, MOMP : Δ49ApoA1		0.02	0.32	0.64	3.46	6.55	20.04
Nombre estimé d’insertion de MOMP par tNLP		0.03	0.37	0.75	4.04	7.65	23.39

Tableau 4 : Les rapports plasmidiques dans une réaction acellulaire et les taux d’insertion MOMP qui en résultent. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; Δ49ApoA1 = Dérivé ApoA1 de souris marqué.

Discussion

La chlamydia est l’infection sexuellement transmissible la plus courante qui touche les hommes et les femmes. Bien que la recherche sur les vaccins contre la chlamydia s’étende sur des décennies, un vaccin sûr et efficace pouvant être mis à l’échelle de la production de masse est resté insaisissable¹³. Le MOMP chlamydia est considéré comme le principal candidat en tant qu’antigène vaccinal protecteur; cependant, MOMP est très hydrophobe et sujet à un pliage incorrect^14,15. D’autres études ont révélé que le MOMP existe dans des états oligomères essentiels à son immunogénicité¹¹. Détaillé ici est une méthode de co-expression validée et sans cellules qui produit un MOMP oligomère formé dans une nanoparticule tNLP en tant que vaccin, avec des rendements d’environ 1,5 mg de MOMP purifié par 3 ml de lysat. Cette procédure entièrement collationnée peut être mise à l’échelle pour la production industrielle, ce qui augmente ses perspectives en tant qu’approche utile pour la génération de vaccins.

Nous avons déjà publié sur l’utilisation de l’expression acellulaire pour produire des protéines membranaires intégrées dans les PNL ^3,16, ainsi que l’expression dans des disques stabilisés par les télodendrimères. Cependant, cette dernière technique a produit des particules membrane-protéine avec une plus grande hétérogénéité et une solubilité plus faible. ⁴ De plus, l’immunogénicité des particules MOMP-télodendrimères n’est pas claire par rapport aux particules MOMP-tNLP⁶.

Cette procédure peut être adaptée pour intensifier l’expression des protéines membranaires bactériennes qui sont des candidats prometteurs en tant qu’antigènes pour une utilisation dans les vaccins sous-unitaires. Non seulement cette procédure produit une protéine membranaire bactérienne solubilisée, mais la structure globale des nanoparticules est susceptible d’être modifiée à l’aide d’une variété d’adjuvants vaccinaux lipophiles, y compris, mais sans s’y limiter, le CpG conjugué à une fraction cholestérol ou FSL-1. L’expression d’autres antigènes candidats à partir de bactéries est possible, bien que des paramètres tels que la température d’expression, le choix des lipides et le type de système d’expression puissent devoir être explorés pour obtenir des rendements optimaux.

De plus, le choix et le rapport plasmidique sont essentiels dans ce processus. Les deux plasmides utilisés doivent être construits à partir de la même colonne vertébrale. Si les inserts ont approximativement la même longueur, les rapports peuvent être basés sur la masse du plasmide ajouté, comme décrit ici. Cependant, le ratio basé sur les taupes donnera des résultats plus reproductibles, en particulier lors de la mise à l’échelle des réactions. Les rapports qui fonctionnent bien dans les réactions à l’échelle du crible (< 0,5 mL) peuvent ne pas être applicables aux réactions plus importantes et peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire. Les protéines non membranaires peuvent toujours être exprimées à l’aide de kits acellulaires, mais peuvent ne pas nécessiter la nanoparticule lipidique (co-expression) pour produire un produit soluble. De plus, bien que ce protocole décrive l’adjuvant avec CpG et FSL-1, ce système se prête à la formulation avec d’autres adjuvants lipophiles ou au mélange avec des adjuvants solubles selon les besoins.

Il est essentiel d’éviter la contamination lors de la mise en place de la réaction d’expression acellulaire car cela peut affecter les rendements. Tous les additifs à la réaction, y compris les plasmides eux-mêmes, doivent être très purs. De plus, les protéines exprimées ne doivent être en contact qu’avec des matériaux et des solutions exempts de contamination par les endotoxines. La contamination par les endotoxines dans les formulations candidates peut entraîner des résultats incohérents et fallacieux des tests immunologiques et peut être nocive en quantités suffisantes. Bien que cela ne soit pas décrit ici, une purification supplémentaire après chromatographie d’affinité au nickel peut être nécessaire si de nombreux contaminants sont observés lors d’étapes d’analyse ultérieures, telles que SDS-PAGE. Cela pourrait être accompli avec la SEC, bien que les conditions puissent nécessiter une optimisation formulation par formulation.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder	Avanti Polar Lipids	850345
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes	Eppendorf	2600028
1 M Trizma hydrochloride solution	Millipore Sigma	T2194
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7%	Millipore Sigma	695092
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Buffer Dam for XCell SureLock	Life Technologies	EI0012
C24 Incubator shaker	New Brunswick Scientific
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit	BiotechRabbit	BR1400201
cOmplete His-Tag Purification Resin	Roche Molecular Diagnostics	5893682001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Molecular Diagnostics	4693132001
CpG-ODN1826	Biosearch Technologies	T9449
D-(+)-Trehalose dihydrate	Millipore Sigma	71509
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi	Millipore Sigma	71508-3
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity	Bio-Rad	7311550EDU
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS)	Millipore Sigma	D8537
Electrophoresis Power Supply
Endosafe PTS cartridge	Thermo Fisher Scientific	NC9594798
Endosafe-PTS Testing System	Charles River
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid
HCl and NaOH solutions for pH adjustment
HPLC with UV-vis diode array detector	Shimadzu
HyClone HyPure culture-grade water	VWR	82007-328
iBlot 2 Dry Blotting System	Life Technologies
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF	Life Technologies	IB24001
Image Studio V2.0 software	Li-COR Biiosciences
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immun-Blot PVDF Membrane	Bio-Rad	1620177
LI-COR Odyssey Fc imager	Li-COR Biiosciences
Lyophilizer	Labconco
Methanol (≥99.9%)	Millipore Sigma	34860
Microcentrifuge
Microwave oven
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	NP000202
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Life Technologies	NP0009
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20	Li-COR Biosciences	927-50000
Orbital Shaker
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)
pIVEX2.4d vector	Roche Molecular Diagnostics
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody	Qiagen	34660
Probe sonicator
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Qubit Protein Assay Kit	Life Technologies	Q33212
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL	Rainin	17002428
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL	Rainin	17002429
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL	Rainin	17002426
Rainin Pipettes	Rainin
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)	Li-COR Biosciences	926-32210
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Life Technologies	LC5925
Sodium chloride NaCl	Millipore Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4	Millipore Sigma	S0751
Superdex 200, 5/150 GL column	Cytiva	GE28-9909-45
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1	Invivogen	tlrl-fsl
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Life Technologies	S12001
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379
UV light source
Vacufuge Bench Top Centrifuge	Eppendorf
Vortexer
VWR 15 mL conicals (89039-666)	VWR
VWR 50 mL conicals (89039-656)	VWR
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )	Life Technologies	EI0001